2020 Fiscal Year Research-status Report
Long-read sequencing across the DM2 repeat expansion reveals unique insight of repeat expansion structure
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20K07740
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
松浦 徹 自治医科大学, 医学部, 教授 (90402560)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 筋強直性ジストロフィー2型 / ロングリードシーケンサー / CCTG伸長リピート |
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| Outline of Annual Research Achievements |
筋強直性ジストロフィー2型 (DM2) は欧米白人に多い常染色体優性遺伝性疾患である。その原因遺伝子変異は数千に及ぶ非翻訳領域CCTGリピート不安定伸長であるが、リピート長のみでその多彩な表現型を説明できず、そのリピート不安定性・病態メカニズムも明らかではない。申請者はこれまで、アジア人初のDM2患者を本邦に見出し、比較ゲノム解析によりCCTGリピートの由来がレトロトランスポゾンであることを明らかにしてきた。しかしながら、本邦DM2の創始者が欧米のそれと同一であるのか、更にそのリピート内部構造は明らかになっていない。そこで、本研究はロングリードシーケンサーを用いて、① 本邦DM2創始者変異の存在をハプロタイプ比較解析により証明、② 従来解析困難であったDM2伸長リピート内構造を解明しようとした。ロングリードシーケンサーPacBio Sequelを用いて解析したところ、伸長リピート変異を含むゲノム構造全体を明らかにすることが困難であることが判明した。そこで、①においては周辺構造のPCR増幅、従来型のシーケンス・ハプロタイプ解析に切り替え、解析を行った。本邦DM2家系のハプロタイプは同一であり、欧米DM2のそれと異なっていた。このことは本邦のDM2が、欧米DM2とは異なる共通の創始者変異に由来することを証明するものである。② については解析を一旦中断し、異なるゲノム解析系導入に取り組んだ。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
筋強直性ジストロフィー2型 (DM2) の原因遺伝子変異は数千に及ぶ非翻訳領域CCTGリピート不安定伸長である。本研究はロングリードシーケンサーPacBio Sequelを用いて、① 本邦DM2創始者変異の存在をハプロタイプ比較解析により証明、② 従来解析困難であったDM2伸長リピート内構造を解明しようとした。ロングリードシーケンサーPacBio Sequelを用いて解析したところ、伸長リピート変異を含むゲノム構造全体を明らかにすることが困難であることが判明した。①においては周辺構造のPCR増幅、従来型のシーケンス、ハプロタイプ解析に切り替え、解析を行った。本邦DM2家系のハプロタイプは同一であり、欧米DM2のそれと異なっていた。② については解析を中断し、新たな解析系の構築に取り組んだ。伸長リピート全体を効率的にシーケンスできるようにCRISPR-Cas9 法を導入し、原理の異なる2つのロングリードシーケンサーPacBio Sequel IIおよびOxford Nanopore PromethIONを用いて克服しようと計画している。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022、2023年度は、CRISPR-Cas9 法をもとに原理の異なる2つのロングリードシーケンサーPacBio Sequel IIおよびOxford Nanopore PromethIONを用いてDM2伸長リピート内構造の早期解明を目指す。DM2病態に重要なRNA結合タンパク（RBPs)の同定のため、ロングリードシーケンスによって明らかにされたリピートシーケンスを利用して、Streptomycin-binding aptamer を含んだリピートRNAに、ヒト筋肉核抽出物と神経核抽出物をそれぞれ混合しagaroseビーズに捕捉後、洗浄溶出させ、mass spectrometryでRBPを網羅的に同定する。リピート内挿入配列の有無・相違でRBPsが異なることが予想され、多彩な表現型を説明できる可能性がある。
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| Causes of Carryover |
当初予定していた解析法では、当初目的の達成に至らないことが判明し、解析を中断した。
新たな解析系の構築に取り組み、2021年度に使用予定である。
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