神経変性疾患由来iPS細胞を用いたin vitro血液脳関門モデル構築と病態解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07741
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 野中 里紗 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (90614248)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 志賀 孝宏 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (50784378) ; 石川 景一 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90733973)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 血液脳関門 / iPS細胞 / 神経変性疾患 / 内皮細胞 / ペリサイト

Outline of Annual Research Achievements

血液脳関門（blood-brain barrier: BBB）は血液と中枢神経系との間の物質交換を制限するバリア機構であり、パーキンソン病などの難治性神経変性疾患において、この破綻が疾患発症と関連するという知見が報告されている。また、BBBの透過性は、中枢神経疾患に対する創薬において候補薬剤のその効果を決定する重要な因子である。本研究は、神経変性疾患患者由来iPSを用いた細胞血液脳関門細胞モデルを確立・解析し、疾患におけるBBB機能破綻機構の解明や新たな治療標的の同定を目指している。本年度は、BBBを構成する主な細胞のうち、内皮細胞、ペリサイト、アストロサイトを健常・疾患由来細胞iPS細胞から分化誘導する方法の確立および細胞特性解析を行うことを予定していたが、COVID-19の影響により細胞培養が行えない期間が長期にあった。培養再開後は、これまでに報告されている分化誘導方法を用いて、健常由来iPS細胞から内皮細胞への分化誘導を行い、分化確認の為に蛍光免疫染色法を行うことで、内皮特異マーカー（VE-Cadherin、PECAM-1/CD31、Claudin-5、ZO-1）の発現検討を行ったところ、それらマーカーを発現が確認できた。同様に、既報の方法を用いて、ペリサイトへの分化誘導を行ったが、分化確認実験である蛍光免疫染色法を行うに至る細胞数を得ることができず、解析に至らなかった。アストロサイトへの分化誘導は、既報の方法は培養期間が長期であるため改良を目指しているが、従来の培養期間より短縮することが出来た。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本年度は、BBBを構成する主な細胞である内皮細胞、ペリサイト、アストロサイトを健常・疾患由来細胞iPS細胞から分化誘導する方法の確立および細胞特性解析を行うことを中心に検討を行う予定であった。しかし、COVID-19の影響により細胞培養が行えない期間が長期にあり、本年度の研究開始が遅れた。また、申請書にて予定していた内皮細胞およびペリサイトの分化誘導法を行う際に使用する試薬の一部が入手困難であった為、分化誘導法の再考・変更を行った為、重ねて開始時期の遅れが生じてしまい研究遂行が遅れている。そこで別の既報の方法を用いて、内皮細胞およびペリサイトへの分化誘導を行ったところ、内皮細胞の分化誘導は蛍光免疫染色法により定性確認を行うことが可能であったが、ペリサイトは蛍光免疫染色法を行うに至る十分量の細胞数を得ることができなかったことから、既報の分化誘導法の調整・再考が再度必要であると考え、調整中である。現在、両細胞とも細胞特性解析には進めていない為、そちらの解析を進める必要がある。

Strategy for Future Research Activity

2021年度は、前年度から行っていたペリサイトの分化誘導法の調整、取得する。並行して、健常・疾患由来細胞iPS細胞から分化誘導した内皮細胞およびペリサイトの細胞特性の解析を行う。更に、分化誘導した内皮細胞、ペリサイト、アストロサイト、神経細胞を用いて、共培養システムにより各種誘導細胞の細胞間相互作用の解析を、タイトジャンクション蛋白 (claudin-5, occluding, ZO-1など) の発現評価、供給・排出輸送系トランスポーター（グルコーストランスポーター（GLUT1）アミノ酸トランスポーターなど）、P糖タンパクの発現を指標とした免疫染色法およびWestern blot 法により検証・評価を行う。これら解析に基づき、内皮細胞、ペリサイト、アストロサイト、神経細胞を用いた共培養系in vitro血液脳関門モデルの構築を試みる予定でいる。構築した共培養系in vitro血液脳関門モデルの検証・評価は、trans-endothelial electrical resistance (TEER)測定によるバリア機能の評価および細胞透過性の評価を行う予定でいる。

Causes of Carryover

本年度は、COVID-19の影響により細胞培養が行えない期間が長期にわたりあり、研究開始が遅れた。また、申請書にて予定していた内皮細胞およびペリサイトの分化誘導法を行う際に使用する試薬の一部が入手困難であった為、分化誘導法の再考・変更を行った為、重ねて開始時期の遅れが生じてしまい、研究遂行が遅れた。そのために、次年度に繰り越しが生じた。また、試薬・消耗品はCOVID-19の影響により入手が不安定な時期が続いており、入荷に時間を要するものがあり、それも繰り越しを生じた一部の理由である。
本年度にも予定していた細胞特性解析が次年度に繰り越したことから、抗体等の消耗品の購入が必要になる。また、構築予定でいる共培養系in vitro血液脳関門モデルの検証・評価に必要な機器製品の購入を検討しているため、次年度への繰り越しが生じた。