神経変性疾患由来iPS細胞を用いたin vitro血液脳関門モデル構築と病態解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07741
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 野中 里紗 順天堂大学, 大学院医学研究科, 特任助教 (90614248)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 志賀 孝宏 順天堂大学, 大学院医学研究科, 特任助教 (50784378) ; 石川 景一 順天堂大学, 大学院医学研究科, 准教授 (90733973)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 血液脳関門 / iPS細胞 / 内皮細胞 / ペリサイト / 神経変性疾患

Outline of Annual Research Achievements

血液脳関門（blood-brain barrier: BBB）は血液と中枢神経系との間の物質交換を制限するバリア機構であり、この血液脳関門の破綻がパーキンソン病などの難治性神経変性疾患の疾患発症と関連するという知見が報告されている。本研究は、神経変性疾患患者由来iPSを用いた細胞血液脳関門細胞モデルを確立・解析し、疾患における血液脳関門の機能破綻機構の解明や新たな治療標的の同定を目指している。本年度は、前年度からの引き続き、内皮細胞、ペリサイトの分化誘導法の取得を予定しており、並行して、健常・疾患由来細胞iPS細胞から分化誘導した内皮細胞およびペリサイトの細胞特性の解析を行うことを予定していた。本年度は、複数の健常由来iPS細胞から内皮細胞への分化誘導を行い、内皮特異マーカーの発現を指標に分化誘導法を検討していたが、健常由来iPS細胞の複数株において、内皮特異マーカーの発現が確認でき、安定的に分化誘導を行えた。また、ペリサイトへの分化誘導は、昨年度は、安定的に十分な細胞数を得られず特性解析に至っていなかった為、本年度は分化誘導法を変更した。ペリサイト分化誘導法の変更後、解析に必要な細胞数を得ることができ、健常由来iPS細胞の複数株において、ペリサイト特異マーカー（αSMA、Calponin）の発現が確認できた。アストロサイトへの分化誘導は、培養期間の短縮に加え、誘導効率の改良を行っており、高効率にアストロサイトへの分化誘導が可能になった。これらの検討をふまえ、現在は共培養モデルの構築に向けて検討を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は、昨年度に引き続き、血液脳関門を構成する主な細胞である内皮細胞、ペリサイト、アストロサイトを健常・疾患由来iPS細胞から分化誘導する方法の確立および細胞特性解析を行うことを中心に検討を行う予定であった。昨年度に引き続き、内皮細胞分化誘導法の確立および特性解析を行い、複数の健常由来iPS細胞から内皮細胞を分化誘導することができ、蛍光免疫染色にて内皮細胞マーカーの発現を指標に定性確認ができた。またペリサイト分化誘導は、昨年度行っていた方法から新たに誘導方法を変更することで解析可能になり、蛍光免疫染色にて一部であるがペリサイト特異マーカーの発現を確認できた。しかし予定していた疾患由来iPS細胞による解析および健常由来の細胞との比較検討までは進められていないため、そちらの解析を進める必要がある。アストロサイトの分化誘導や神経分化誘導は引き続き解析を進めている。現在は、共培養モデル構築に向けた検討を進めている。

Strategy for Future Research Activity

2022年度は、これまでに行っていた内皮細胞、ペリサイトおよびアストロサイトの分化誘導法から得られる細胞を用いて、それぞれの細胞特性の解析を行うのと並行し、共培養系in vitro血液脳関門の構築を試みる予定でいる。各種細胞を用いての細胞間相互作用の解析を、内皮細胞のタイトジャンクション蛋白 (claudin-5, occluding, ZO-1など) の発現評価、供給・排出輸送系トランスポーター（グルコーストランポーター（GLUT1）アミノ酸トランスポーターなど）、P糖タンパクの発現を指標とした免疫染色法およびWestern blot 法により検証・評価を行う。またペリサイト由来の微小環境タンパク質と内皮細胞のインテグリン受容体を介したシグナルの解析も進める予定でいる。構築した共培養系in vitro血液脳関門モデルにおける機能の検証・評価は、trans-endothelial electrical resistance (TEER)測定によるバリア機能の評価および細胞透過性の評価を行う予定でいる。

Causes of Carryover

本年度は、昨年度行っていたペリサイトの誘導法が解析に十分な細胞量を得られず再度、再考・変更したため、培養時期が遅れていた時期があった。購入試薬を変更することがあったが、昨年度に引き続き試薬・消耗品入手が不安定であった時期が続いており、入荷に時間を要する試薬や消耗品があり、細胞培養を抑えなければならない時期が発生したことがあったことも一部の理由である。本年度にも予定していた細胞特性解析を引き続き行うため、解析に必要な抗体やプライマー等の消耗品の購入が、引き続き必要になるので、次年度へ繰り越した。また、次年度は共培養系in vitro血液脳関門モデルの構築の検討を予定している為、共培養モデルに必要なプラスチック消耗品や試薬の購入が必要になる。ペリサイトの分化誘導法の検討や特性解析が遅れていたため、共培養モデルの検証・評価に必要な機器製品や試薬の購入を次年度へ繰り越した。