神経変性疾患由来iPS細胞を用いたin vitro血液脳関門モデル構築と病態解析

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07741
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 野中 里紗 順天堂大学, 大学院医学研究科, 特任助教 (90614248)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 志賀 孝宏 順天堂大学, 大学院医学研究科, 特任助教 (50784378) ; 石川 景一 順天堂大学, 大学院医学研究科, 准教授 (90733973)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 血液脳関門 / iPS細胞 / 内皮細胞

Outline of Annual Research Achievements

血液脳関門（blood-brain barrier: BBB）は血液と中枢神経系との間の物質交換を制限するバリア機構であり、この血液脳関門の破綻がパーキンソン病などの難治性神経変性疾患の疾患発症と関連するという知見が報告されている。本研究は、健常者および神経変性疾患患者由来iPS細胞を用いて血液脳関門細胞モデルを確立・解析することで、神経変性疾患における血液脳関門の機能破綻機構の解明および治療標的の同定を目指すものである。
本年度は、内皮細胞、ペリサイトの分化誘導法の取得、並行して、健常・疾患由来iPS細胞から分化誘導した内皮細胞およびペリサイトの細胞特性の解析を行うことを予定していた。内皮細胞への分化誘導は、これまでに複数の健常由来iPS細胞から分化誘導を行い、その健常由来の複数株において、内皮細胞特異マーカーの発現を指標に内皮細胞分化能を確認していたが、本年度は、パーキンソン病の疾患由来iPS細胞の複数株を用いて内皮細胞への分化誘導を行い、内皮細胞特異マーカーの発現を確認することが出来た。また、ペリサイトへの分化誘導は、昨年度に変更した分化誘導法を用いて解析に必要な細胞数を得ることができ、健常由来iPS細胞の複数株において、ペリサイト特異マーカーの発現が確認していたが、本年度は、パーキンソン病の疾患由来iPS細胞の複数株を用いて分化誘導を行い、健常由来と同様にペリサイト特異マーカーの発現を確認ができた。iPS細胞からアストロサイトへの分化誘導は、培養期間の短縮に加え、誘導効率の改良を行っており、高効率にアストロサイトへの分化誘導が可能になっている。現在は共培養モデルの構築に向けて検討を進めており、バリア機能や細胞透過性の評価等および各種細胞の細胞間相互作用の解析を行う予定でいる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は、昨年度に引き続き、血液脳関門を構成する主な細胞である内皮細胞、ペリサイト、アストロサイトを健常・疾患由来iPS細胞から分化誘導する方法の確立および細胞特性解析を行うことを中心に検討を行う予定であった。昨年度に引き続き、内皮細胞分化誘導法の確立および特性解析を行い、複数の健常由来iPS細胞および疾患由来iPS細胞から内皮細胞を分化誘導することができ、蛍光免疫染色にて内皮細胞マーカーの発現を指標に定性確認が可能であった。またペリサイトへの分化誘導は、昨年度変更した誘導方法を用いることで、複数の健常由来iPS細胞および疾患由来iPS細胞からペリサイトへの分化誘導ができ、蛍光免疫染色にてペリサイト特異マーカーの発現を確認できた。しかし予定していた疾患由来iPS細胞および健常由来のiPS細胞から分化誘導した各種細胞の比較検討までは進められていないため、そちらの解析を進める必要がある。並行して、昨年度予定していた共培養モデル構築に向けた検討も引き続き検討を進めているが、解析まで至っていない。また、iPS細胞からのアストロサイトの分化誘導や神経分化誘導は引き続き解析を進めている。

Strategy for Future Research Activity

2023年度は、健常由来および疾患由来iPS細胞から内皮細胞、ペリサイトおよびアストロサイトの分化誘導法から得られる細胞を用いて、それぞれの細胞特性の解析を行う予定でいる。各種分化細胞を用いてtrans-endothelial electrical resistance (TEER)測定によるバリア機能の評価およびSodium fluorescein (Na-F) による細胞透過性の評価、供給・排出輸送系トランスポーター（グルコーストランスポーター（GLUT1）など）、P糖タンパクの発現およびそれら輸送能の評価を行い、検証・評価する。また、並行して検討する共培養系in vitro血液脳関門モデルの構築を検討する予定であり、その機能の検証・評価は、trans-endothelial electrical resistance (TEER)測定によるバリア機能の評価および細胞透過性の評価を行う予定でいる。共培養モデルを用いて、各種細胞の細胞間相互作用の解析も行う予定でおり、内皮細胞のタイトジャンクション蛋白 (claudin-5, occluding, ZO-1など) の発現評価、供給・排出輸送系トランスポーター（グルコーストランポーター（GLUT1）アミノ酸トランスポーターなど）、P糖タンパクの発現を指標とした免疫染色法およびWestern blot 法により検証・評価を行う。またペリサイト由来の微小環境タンパク質と内皮細胞のインテグリン受容体を介したシグナルの解析も進める予定でいる。

Causes of Carryover

本年度は、別業務の増加にて、本研究に費やす時間が減ってしまった為、計画していた実験を推進させることが難しかったため、延長を申請し、次年度への繰り越しが発生した。本年度は、予定している細胞特性解析を引き続き行うため、細胞培養試薬およびそれら解析・評価に必要な抗体やプライマー等の消耗品の購入が、引き続き必要になるので、次年度へ繰り越した。また、次年度は共培養系in vitro血液脳関門モデルの構築の検討を予定している為、共培養モデルに必要なプラスチック消耗品や試薬の購入が必要になる。また培養モデルを用いた、バリア機能の評価および細胞透過性の評価の為の試薬の購入を予定している。並行して、各種細胞の細胞間相互作用の解析も行う予定でおり、解析・評価に必要な抗体および試薬の購入する予定でいる。