痛み行動の性差発現における分界条床核背外側CRHニューロンの役割

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07747
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 萩原 裕子 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (90468207)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 舩橋 利也 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (70229102)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 疼痛 / 分界条床核外側部 / venus / ホルマリンテスト / オプトジェネティクス（光遺伝学） / TRECK法

Outline of Annual Research Achievements

我々は、これまでの研究で、痛み刺激としてホルマリンテストを用い、一度痛みが抑制される時期に性差が認められること、その時期に分界条床核背外側部 (dlBST) で雌性特異的にCREBのリン酸化が起こることを明らかにした 。また、同部位はCorticotropin-releaseing hormone (CRH) ニューロンが局在している特徴的な領域でもある。CRHニューロンは、情動と関連の強い扁桃体にも多く発現しており、扁桃体のCRH ニューロンと分界条床核のCRH ニューロンは相互に密接に連絡している。本研究の目的は、分界条床核背外側部 (dlBST) のCRHニューロンが、痛み行動の性差発現にどのような役割を演じているか、を検討することにある。そのために、遺伝子改変動物とウィルスベクターを組み合わせて利用し、オプトジェネティクス（光遺伝学）やTRECK（ジフテリア毒素受容体を介した細胞ノックアウト）の変法などの神経細胞に選択的な活動操作技術を用いる。性差発現は、ホルマリンによる痛み反応の場合、中間相という限定した時間にのみ顕著なため、光遺伝学的手法という時間分解能に優れた方法が主となる。
本研究ではCRH-Creラット (Dr. Robert Messing作成 [RRRC#:00852]) を使用し、dlBSTにおけるCRHニューロン選択的な操作によるホルマリン誘発性痛み行動の性差の変容について検討する。本ラットをジャクソン社からの輸入の手続きを取ったが、新型コロナウィルス(Covid-19)の影響により半年以上入荷が遅れた。2020年末に入荷でき、繁殖およびジェノタイプなどを行い準備段階が整ったところで2020年度が終了した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本研究ではCRH-Creラット (Dr. Robert Messing作成 [RRRC#:00852]) を使用し、dlBSTにおけるCRHニューロン選択的な操作によるホルマリン誘発性痛み行動の性差の変容について検討する。そのためには、CRH-Creラットの存在が必須となる。本ラットをジャクソン社からの輸入の手続きを取ったが、新型コロナウィルス(Covid-19)の影響により半年以上入荷が遅れた。2020年末に入荷でき、繁殖およびジェノタイプなどを行い準備段階が整ったところで2020年度が終了した。そのため、現段階では実験が遅れているが既にCRH-Creラットの入荷が終わっているために次年度は実験が進むものと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

雌雄のラットに、AAVをもちいた遺伝子導入によって光応答性タンパク質をCRHニューロンに発現させ、目的とするdlBSTに光を照射し、痛み行動の応答変化を検討する。CRH-CreラットのdlBSTに脳定位固定装置を用いて、①AAV-EF1a-DIO- hChR2(C128s/D156A)-EYFP (AAV9) (addgene,#35503) 、もしくは、②AAV-EF1a-DIO-eNpHR3.0-EYFP (AAV9) (addgene,#26966) を投与する。同時に、光ファイバーを脳に挿入留置し、dlBSTに光ファイバーの先端を固定する。脳手術１ヶ月後、ホルマリンテストを行い、光ファイバーの先端から特定波長の光を照射しCRHニューロンを興奮、もしくは抑制させ、行動の変化を観察する。
さらに、性腺を摘出した雌雄のCRH-Creラットにエストロジェンとしてエストラジオール (E2) もしくは、テストステロン (Test) を補充し実験を用いる。ラットのdlBSTに脳定位固定装置を用いて、先の①、② のウィルス を投与し、同時に、光ファイバーを脳に挿入留置し、dlBSTに光ファイバーの先端を固定する。脳手術１ヶ月後、ホルマリンテストを行い、光ファイバーの先端から特定波長の光を照射しCRHニューロンを興奮、もしくは抑制させ、行動の変化を観察する。
最適な刺激条件は、実験1，2においてAAVの効果を確認するため、スライスパッチクランプ法を用いて、光刺激による効果をmEPSCおよびmIPSCを計測して決定する。

Causes of Carryover

CRH-Creラットをジャクソン社からの輸入の手続きを取ったが、新型コロナウィルス(Covid-19)の影響により半年以上入荷が遅れた。そのため、現段階では実験が遅れており予定の実験ができていないために、使用予定金額が減少している。
しかし、既にCRH-Creラットの入荷が終わっているため、予定通り実験が進むものと考えられ、予定通りの費用を使用する。
また、新型コロナウィルス(Covid-19)の影響により参加予定であった学会が中止やオンライン開催になることで旅費や参加費がなかったことも一因である。