2020 Fiscal Year Research-status Report
タウタンパク質のリン酸化におけるATBF1機能解析
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20K07762
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
鄭 且均 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (00464579)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
道川 誠 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40270912)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | アルツハイマー病 / 糖尿病 / インスリン欠乏 / ATBF1 / タウタンパク質リン酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖尿病はアルツハイマー病(AD)の危険因子であり、特に脳内のインスリン欠乏はタウタンパク質をリン酸化させ、認知機能障害を引き起こす。申請者らは、１）ADモデルマウスでストレプトゾトシン投与により１型糖尿病を誘発させ、脳内で変動する分子を２次元電気泳動-質量分析法で網羅的に解析した結果、転写因子であるATBF1の発現レベルが減少することを発見した。本研究の目的は、①インスリン欠乏によるATBF1発現減少メカニズムと、②タウタンパク質のリン酸化におけるATBF1の機能を明らかにすることである。
本年度は、インスリン欠乏によるATBF1発現減少メカニズムを解明するため、ラット由来の初代神経培養細胞およびN2AP301L細胞にインスリンを処理するとATBF1のmRNAおよびタンパク質レベルはインスリン濃度依存的に増加した。また、インスリン受容体の主な下流シグナルであるPI3Kの阻害剤を前処理した後、インスリンを処理すると、インスリンによるATBF1発現レベルの増加が見られなかった。この結果から、ATBF1発現はインスリンシグナルによって制御されることが示唆された。また、N2AP301L細胞にATBF1を過剰発現させるとタウタンパク質のリン酸化が亢進し、ATBF1をノックダウン することでタウタンパク質のリン酸化が抑制された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究計画は、インスリン欠乏によるATBF1発現減少メカニズムの解明と、タウタンパク質のリン酸化におけるATBF1の機能を明らかにすることである。まず、インスリン欠乏によるATBF1発現減少メカニズムは計画通り行い、ラット由来の初代神経培養細胞およびN2AP301L細胞にインスリンを処理すると、ATBF1のmRNAおよびタンパク質レベルはインスリン濃度依存的に増加した。また、インスリン受容体の主な下流シグナルであるPI3Kの阻害剤を前処理した後、インスリンを処理するとインスリンによるATBF1発現レベルの増加が見られなかった。すなわち、ATBF1発現はインスリンシグナルによって制御されることが示唆された。また、タウタンパク質のリン酸化におけるATBF1の機能解析も計画通り行い、N2AP301L細胞にATBF1を過剰発現させるとタウタンパク質のリン酸化が亢進し、ATBF1をノックダウンすることでタウタンパク質のリン酸化が抑制された。
しかし、タウタンパク質のリン酸化に関わる酵素（GSK3β、CDK5、JNKなど）およびタウタンパク質の脱リン酸化に関わる酵素（PP1、PP2Aなど）の発現におけるATBF1の機能解析はサンプル数が十分に得られなかったため少し遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）細胞を用いたタウタンパク質のリン酸化におけるATBF1の機能解析；初代神経培養細胞およびN2AP301L細胞にATBF1をノックダウンまたは過剰発現させた後、インスリンを処理し、タウタンパク質のリン酸化に関わる酵素（GSK3β、CDK5、JNKなど）やタウタンパク質の脱リン酸化に関わる酵素（PP1、PP2Aなど）のリン酸化をウェスタンブロティングで確認する。
２）インスリン欠乏ATBF1(+/-)マウスの作成；野生型マウスおよびATBF1(+/-)マウスにストレプトゾトシ(STZ)を投与し、インスリン欠乏マウスを作成する。このマウスを用いて、①血糖値、②ELISA法を用いて血漿インスリンレベルの測定、③タウタンパク質のリン酸化をウェスタンブロティングで確認、④タウリン酸化に関わる酵素（GSK3β、CDK5、JNKなど）やタウタンパク質の脱リン酸化に関わる酵素（PP1、PP2Aなど）のリン酸化をウェスタンブロティングで確認する。
３）ATBF1(+/-)とAPP-KIマウスの交配マウス作成と解析；ATBF1(+/-)とAPP-KIマウスの交配マウスにSTZを投与し、４ヶ月後に、①血糖値、②ELISA法を用いて血漿インスリンレベルの測定、③認知機能テスト、④タウタンパク質のリン酸化、⑤細胞死やシナプス関連タンパク質の解析などを行う。
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| Causes of Carryover |
当初購入を予定していた、抗体およびtransfection試薬の購入費が少なく済んだため。またコロナの影響で学会参加費、旅費が不要であった。
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