アセチルコリン受容体部位特異的自己抗体産生による重症筋無力症モデルマウスの作成

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07766
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 紺野 晋吾 東邦大学, 医学部, 講師 (50459765)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 実験的重症筋無力症モデル

Outline of Annual Research Achievements

令和２年度はヒトAChRα1 subunitのMIR構造を模した人工合成ペプチドを用いて実験的重症筋無力症マウスを作製できるか検討した．使用したマウス種はC57BL/6のメス・7週齢．抗原はAChRα1 subunitの主要免疫原性領域に相当するa67-76部のアミノ酸配列（WNPDDYGGVK）を原型とし、同配列内のNPD部位に三次元ループ構造を再現した人工合成ペプチドを作成した．これとキャリア蛋白と結合させた複合体をとcomplete Freund's adjuvant（CFA）とともに初回と28日後に足底と頭皮皮下に注射し免疫した（免疫群）．非免疫マウス群（C１群），キャリア蛋白＋CFAのみ投与群（C2群）を対照群とした．臨床症状および易疲労性の観察を．初回免疫日から免疫後45日目まで臨床症状と体重を連日観察し，免疫後1週間ごとに握力と懸垂力を測定した. 体重および握力は全3群間で免疫前と免疫45日後ともに有意差認めなかった．10秒間以内に可能な懸垂数は免疫群で低下したが他群と有意差はなかった．全3群で坐骨神経の反復刺激で腓腹筋で記録した複合活動電位は漸減現象は観察されなかった．また全群で腓腹筋を用いた組織学的検討では炎症細胞浸潤はなく，免疫組織化学的検討でも神経筋接合部に対する補体C3沈着は明らかではなかった．Real timePCR法での検討では，腓腹筋のAChRα1およびα7のｍRNA発現はAChRα1がC1群＞C2 群＞免疫群の順に減少していた．リンパ節および脾臓のサイトカインｍRAN発現はC1群に比してC2群，免疫群でIL-17の増加が確認された.

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本年度は概要の方法で実験的重症筋無力症マウスを作製を試みたが神経筋接合部障害を証明する電気生理学的な易疲労性所見，組織学的に自己免疫反応の存在の証明ができなかった．新型コロナ感染症の流行に伴う実験動物搬入や実験試薬の入手の遅延から複数回の実験を行うことが困難であった.

Strategy for Future Research Activity

引き続き人工合成ペプチドを用いて実験的重症筋無力症マウスを作製を行う．免疫の方法は実験的重症筋無力症マウスを作製ガイドライン（Experimental Neurology 2015 ;270:11-17）に準じて最大3回までの免疫を行う. 抗原性を増強する構造を有する人工ペプチドの複数の試作を行うことも視野に入れている．候補となるペプチドとして，KKCYG-α67～76-VCT, CR-α67～76-K（a74:GlyをCysに置換）またはCKGGLR-α67~76-KC のアミノ酸残基a76:LysをAla,His,Agrへ置換する方法などを考えている．

Causes of Carryover

令和2年度は世界的新型コロナ感染症が流行し,実験動物の搬入や実験試薬の海外からの取り寄せが遅延し，結果として実験回数が減少したため物品費の支出が減少した．また例年であれば参加する予定であった学術集会が中止，または延期となり参加登録費やそれに関連する旅費支出が予定よりも少額であった. 令和3年度では研究計画調書の通り実験を進め，実験に必要な実験動物，試薬，消耗品などの購入に物品費やその他支出をあてる．旅費については新型コロナ感染症対策の元に行われる学術集会に参加（現地参加またはWeb開催）することに使用する予定である.