2021 Fiscal Year Research-status Report
難治性の神経因性疼痛を抑制する脳由来新規生理活性物質の構造決定と生理作用の解析
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20K07768
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| Research Institution | Kyoto Tachibana University |
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Principal Investigator |
池田 哲也 京都橘大学, 健康科学部, 教授 (20264369)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井田 隆徳 宮崎大学, フロンティア科学総合研究センター, 准教授 (00381088)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | アロディニア / APGWamide / 神経因性疼痛 / 神経障害性疼痛 / CCIモデルラット / 絞扼性神経損傷モデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、神経因性疼痛患者に見られるアロディニアの効果的な治療薬の開発を目指し、神経因性疼痛モデルラットに見られる疼痛行動であるアロディニアをバイオアッセイ系に用いて、ニワトリ脳神経系から新規抗アロディニア活性物質を単離精製し、その立体構造を明らかにし、生理活性を詳細に解析することを目的にしている。昨年度に、まず効率よく精製を進めていくためバイオアッセイ系の開発を行った。飼育の容易さ、動物に与える苦痛の軽減、また、アロディニアを示すまでの期間を短縮するために、ラットの座骨神経を圧迫するCCI（絞扼性神経損傷）モデルを開発した。CCIモデルは腸由来の吸収糸で座骨神経を絞扼し、慢性の損傷を引き起こす方法が一般的であるが、本研究ではポリプロピレンのチューブを用いて神経を圧迫する方法を用いた。週齡の進んだラット（神経が太い）を用いたり、圧迫する座骨神経の部位、圧迫する範囲等を工夫することによって効率よくCCIモデルを作ることが出来るようになった。このCCIモデルラットをバイオアッセイに用いて、800羽分のニワトリ脳組織をホモジナイズし、ゲルろ過、数段階のHPLCから得られた画分をアッセイして、数種の活性画分を得ることが出来た。本年度は、紫外吸収でシングルピークを示す精製物を得ることが出来2種の物質について、分析を行った。非常に量が少なかったため、構造決定は至らなかった。本研究の申請書の計画に挙げた「①新規抗アロディニア活性物質の単離精製法の確立、②構造解析、③合成物を作製し、生理機能を明らかにする」の中で、「①新規抗アロディニア活性物質の単離精製法の確立」と「②構造解析」まで進めることができた
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は「新規抗アロディニア活性物質」の構造を決定することを目指していたが、「新規抗アロディニア活性物質の単離精製法」は確立することが出来たが、構造を決定するまでは至っていない。原因としては、コロナの影響もあり、精製に時間を要したこと、精製物が非常に少量で分析が非常に困難であったこと等があげられる。今後は、①さらに効率のいいバイオアッセイ法の開発。②残っている他の活性画分から抗アロディニア活性物質を単離精製し、最終精製物を得て、構造分析まで進めていきたいと考えている。③さらに出発物質であるニワトリ脳の量を増やして、もう1度単離精製することも視野に入れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究で、「新規抗アロディニア活性物質」の最終精製物が非常に少なかったので、構造解析が困難であった。次年度は、予定を変更してアッセイ系を改良し、さらに効率良く精製する方法を開発する。現在アロディニアのアッセイにvon Frey フィラメントによる「機械的アロディニア」を使ったアッセイ法を使用しているが、熱プローブを用いた「熱アロディニア」によるアッセイ法の開発を行う。現在、残っている活性画分からさらに精製を進め、「機械的アロディニア」と「熱アロディニア」の両方のアッセイ法で最終精製物を得て、構造分析まで進めていきたいと考えている。この結果を基に新規抗アロディニア生理活性物質を合成し、HPLC 等を用いて「物理化学的」に、また、バイオアッセイで「生物学的」に天然物と比較し、同一の物質であることを確認する。以降は合成物を用いて抗アロディニア活性やその濃度反応関係等を詳細に調べる。また、既存のレセプターアンタゴニスト等を用いて、関与する他の伝達物質を特定し、新規活性物質の薬理学的情報を蓄積し、その生理機能を明らかにする。そのためには、von Frey フィラメントによるアロディニアに対する行動実験だけでなく、プランター式鎮痛効果測定装置やランダルセリット式鎮痛効果測定装置等を用いて、痛覚そのものに対する新規の活性物質の作用も詳細に調べる必要がある。
さらに、この合成物を使って抗体を作製し、ニワトリやラットの脳および脊髄で免疫組織化学的解析を行うことによって、新規抗アロディニア活性物質の脳脊髄内での分布を調べ、解剖学的な情報を蓄積する。さらに、ラット脳における関連物質の探索へと研究を広げていく。最終的には新規抗アロディニア活性物質の構造と活性を基に、さらに強力な抗アロディニア活性を持つ物質の構造を検討し、有用なアロディニアの治療薬の開発を目指す。
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| Causes of Carryover |
本年度は効率よくバイオアッセイが行えたため、ラットの匹数を抑えることが出来た。ため、使用するラットの匹数を予定より減らすことができた。また、「新規抗アロディニア活性物質」が構造決定できなかったため、アロディニアだけでなく、痛覚そのものに対する新規の活性物質の作用も詳細に調べるために購入を計画していたプランター式鎮痛効果測定装置やランダルセリット式鎮痛効果測定装置等を購入することを延期した。次年度は、次年度使用額と次年度の予定額を合わせて、上記の実験装置を購入し研究を進めていく予定である。
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