2021 Fiscal Year Research-status Report
分子異常フィブリノゲンの細胞外マトリックス機能に与える影響の評価と重要部位の同定
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20K07799
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
奥村 伸生 信州大学, 学術研究院保健学系, 特任教授 (60252110)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
樋口 由美子 信州大学, 学術研究院保健学系, 講師(特定雇用) (40757241)
平 千明 信州大学, 学術研究院保健学系, 助教 (40779310)
新井 慎平 信州大学, 学術研究院保健学系, 助教 (70866053)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | フィブリノゲン / フィブリン / 血管内皮細胞 / 皮膚線維芽細胞 / 遊走能 / 管状構造形成能 / 形質転換能 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血管新生・創傷治癒などに必要とされるフィブリノゲン(Fbg)あるいはフィブリン(Fbn)における変異Fbg及び変異Fbg由来のFbnモノマー（FM）の機能について、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC)を用いて以下の3機能を検討した。
①遊走能：FbgあるいはFM接着プレートにHUVECを培養し、発育後細胞の一部を剥がし、VEGF存在下で24時間培養し、遊走細胞数をカウントした。その結果、正常Fbg/FMでは非接着対照と比較して大きな差がなく、変異Fbgでは予測に反して増加傾向が観察された。
②管状構造形成能：正常ヒト皮膚線維芽細胞を72時間培養後、HUVECをFbg/FM存在下で72時間培養し、管状構造の形成をマウス抗ヒトplatelet-endothelial cell adhesion molecule-1(PECAM-1)とALP標識抗マウスIgG抗体・BCIP/NBTで染色して、管状構造形成を観察した。その結果、BβG15CFbg添加において正常Fbgより分岐がなく、短く、太い構造が観察された。また、変異FM添加では、γR275H, γD364Hにおいて正常FMより短い構造が、AαR16Hでは長い構造が観察された。一方、BβG15Cでは分岐が少なく、短く、太い構造が観察された。
③内皮間葉転換能(EndMT)：FbgあるいはFM接着プレートにHUVECを培養後、TGFβ2を添加し48時間培養し、形態変化と細胞中間葉系マーカー(CDH2とvimentin)のmRNAを定量した。その結果、形態変化・mRNA定量とも、いずれの変異型FbgあるいはFMにおいても、正常FbgあるいはFMと比較して有意な差を認めなかった。
以上の実験結果より、変異FbgあるいはFMは正常FbgあるいはFMと比較して、HUVECの管状構造形成能（血管新生）に影響を及ぼしている可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の2年目の研究計画であった、フィブリノゲン(Fbg)あるいはフィブリン(Fbn)における変異Fbg及び変異Fbg由来のFbnモノマー（FM）の機能について、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC)を用いて、遊走能、管状構造形成能、形質転換能の3種を評価できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
＜令和４年度＞ 好中球のNETs形成能と単球のマクロファージ(Mφ)分化能
炎症に関係する機能として、感染症、血栓症、動脈硬化などで検出される好中球のNETs形成能と、感染初期に活躍するM1 Mφや抗炎症・免疫抑制に働くM2 Mφの単球からの分化能を以下の方法で評価する。
①FbgあるいはFMコーティングプレートに正常ヒト好中球を播種し、LPSあるいはPMAで刺激しNETosis Imaging Assay Kitの試薬を添加し、6時間まで経時的に蛍光顕微鏡下で観察し、1時間ごとのNETs形成率の変化を求める。
②FbgあるいはFMコーティングプレートに正常ヒト単球（CD14+）を播種し、GM-CSFあるいはM-CSFを添加して6日間培養し、それぞれM1 MφあるいはM2 Mφに分化したことを、培養上清のIL-12あるいはIL-10産生量を測定することにより評価する。
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| Causes of Carryover |
mRNA定量用試薬が2キット必要になると計画していたが、細胞培養が三重測定ができす二重測定としたために、1キットで間に合った。このため令和3年度の残額61,858円は次年度の研究で使用する細胞分化同定用抗体を1種類増やす計画である。
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[Journal Article] Automated screening procedure for phenotype of congenital fibrinogen disorder using novel parameters, |min1|c and Ac/|min1|c obtained from clot waveform analysis of Clauss method2021
Author(s)
Arai S, Kamijo T, Kaido T, Yoda M, Shinohara S, Suzuki T, Arai N, Sugano M, Uehara T, Okumura N.
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Journal Title
Clinica Chimica ACTA
Volume: 521
Pages: 170-176
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] A novel homozygous variant of the thrombomodulin gene causes a hereditary bleeding disorder2021
Author(s)
Osada M, Maruyama K, Kokame K, Denda R, Yamazaki K, Kunieda H, Hirao M, Madoiwa S, Okumura N, Murata M, Ikeda Y, Watanabe K, Tsukada Y, Kikuchi T
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Journal Title
Blood Advance
Volume: 5
Pages: 3830-3838
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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