CalDAG-GEF1の止血分子メカニズム解明と新規機能の探索

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K07808
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 古城 剛 鹿児島大学, 鹿児島大学病院, 臨床検査技師 (30837282)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山口 宗一 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (20325814) ; 大山 陽子 鹿児島大学, 鹿児島大学病院, 医員 (20583470) ; 竹之内 和則 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (30646758) ; 小浜 祐行 鹿児島大学, 鹿児島大学病院, 臨床検査技師 (50837276) ; 橋口 照人 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (70250917)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 血小板機能異常症 / 血小板シグナリング / カルシウム / RasGRP2 / Rap1

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、CalDAG-GEFI の血小板およびその他の血球系、血管内皮細胞における役割を明確にし、症例のアミノ酸変異がそれらの機能の連関に及ぼす影響を検討することにある。止血異常を伴う血小板機能異常症の症例の一家系において、全エクソーム解析を行い Calcium‐and diacylglycerol‐regulated guanine exchange factor‐I(CalDAG-GEFI) をコードする RAS guanyl-releasing protein-2 (RASGRP2) 遺伝子の変異を同定した。CalDAG-GEFI は Rap1 の活性化を介して αIIbβ3integrin の inside‐out signaling を担う分子であり、血小板活性化の重要分子である。本研究では、CalDAG-GEFI の血小板における機能解析を行い、その制御機構を明らかにし、我々の解析した遺伝子変異家系の変異による機能変化を検討する。またRasGRP2は血小板内カルシウムの量を感知してシグナルを受け渡す。 RasGRP2 の860番目の塩基の一塩基置換(C→T)した変異をもつ発現ベクターを作成し、アゴニストの種類、刺激量、刺激時間によるRap1の発現を検討した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

RasGRP2 の860番目の塩基の一塩基置換(C→T)した変異をもつ発現ベクターを作成し、HＥK293、Meg01細胞にWild type・Mutant typeプラスミドの導入の検討をおこない、アゴニストの種類、刺激量、刺激時間によるRap1の発現を検討した。ADP・TRAP・コラーゲン・PMAの4種類のアゴニストを用いて、刺激濃度、刺激時間でのRap1の発現の検討を行った。ADP・TRAP・コラーゲン刺激ではWild type・Mutant typeのTotal-Rap1の発現は、HEK293、Meg01、両typeともに発現を認めたが、Rap1 の発現は認められなかった。アゴニストにA23187を追加し、刺激濃度、刺激時間でのTotal-Rap1・Rap1の発現の検討中である。

Strategy for Future Research Activity

1. 各細胞株におけるCalDAG-GEFI 関連分子の検討
それぞれの細胞に血小板で確認できたCalDAG-GEFI 関連分子が発現しているかをさらに検討する。過去の報告にあるCalDAG-GEFI 関連分子を探索し、これらの発現も併せて確認する。
2. アゴニストによる刺激によるCalDAG-GEFI を介したシグナルの検討
1で確認できた分子について、そのシグナル伝達に関してウエスタンブロット法で検討する。また、CalDAG-GEFI をノックダウンして、このシグナルの変化を調べる。

Causes of Carryover

コロナ禍で業務が多忙になり、実験を思うように進めることが出来なかった。