2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of novel diagnostic system using exsomes
| Project/Area Number |
20K07817
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology |
|---|
Principal Investigator |
伊藤 雅史 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究員 (80393114)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川上 恭司郎 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究員 (90589227)
水谷 晃輔 岐阜大学, 医学部附属病院, 准教授 (80397356)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | エクソソーム / 細胞外小胞 / アルツハイマー病 / 診断法 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細胞から分泌されるエクソソームは由来する細胞の特徴を反映することから、体液中エクソソームは新たなタイプのバイオマーカーとして期待されている。本研究では、新規方法を用いて血清から単離したエクソソーム中のアミロイドベータ・リン酸化タウ蛋白の検出によりアルツハイマー病と対照の鑑別が可能かどうかを検証するとともに、プロテオーム解析を行い、新規診断マーカーの候補を同定する。続いて、マーカーの検出システム構築した後に多検体で解析を行い、アルツハイマー病・MCI（軽度認知機能障害）と対照症例の鑑別における臨床的有用性を検証することを目的としている。
今年度はプロテオーム解析と1候補タンパク質について検出システムの構築を行った。市販のアルツハイマー病および対照症例の血清をそれぞれプールしたものを用いて、フォスファチジルセリン（PS）アフィニティ法により高純度エクソソームを単離した。このエクソソームをトリプシン消化し、安定同位体標識法であるiTRAQ法によりペプチドを標識した後、nano LC-MS/MSにてプロテオーム解析することで、タンパク質を613個同定した。同定したタンパク質のうちアルツハイマー病患者で1.5倍以上増加したものが4個、低下したものが11個選出され、新規エクソソームマーカー候補タンパク質とした。そのうち膜タンパク質を標的として1つの候補タンパク質に対して、PSアフィニティ分子とのサンドイッチELISAを構築するため、数種類の抗体を検討・選出を行った。構築したサンドイッチELISAを用いて、複数の患者および対照検体で評価した結果、有意な差は得られなかったため、他の候補タンパク質についても検討していく予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までに、患者血清由来エクソソームを用いたnano LC-MS/MSによるプロテオーム解析により、発現変化のあるエクソソームマーカー候補を数種類見出している。加えて、候補タンパク質の1つに対して、患者血清を用いたエクソソームサンドイッチELISAによる測定系を構築し、複数検体での測定を行った。以上のことより、おおむね順調に進展していると考えた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
他の候補タンパク質についてのエクソソームサンドイッチELISAによる検証を進めるとともに、検体をプールすることなく解析が可能であるラベルフリー定量によるLC-MS/MSを用いて、個々の検体でのプロテオーム解析を行い、比較することで、より精度の高いマーカー候補タンパク質を同定する。加えて、アミロイドベータやリン酸化タウ蛋白など既存のマーカータンパク質が高純度エクソソーム中にも存在しているのかを検証する予定である。
|
| Causes of Carryover |
エクソソームに関する研究は本研究以外にも行っており、他の研究の試薬と共通するものが多く、使用期限を考慮して既に購入済みの試薬を先に使用するなど、予定の試薬の購入を遅らせる事態が発生したが、基金である利点を活用し、翌年分にスライドすることが可能であったため商品の重複購入を避けることにした。これからプロテオーム解析、ウエスタンブロット解析、ELISA、抗体など研究計画に基づき無駄なく執行していく予定である。
|
