2020 Fiscal Year Research-status Report
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20K08158
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
津村 弥来 広島大学, 医系科学研究科(医), 研究員 (80646274)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡田 賢 広島大学, 医系科学研究科(医), 教授 (80457241)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 原発性免疫不全症 / 複合免疫不全症 / ユビキチン修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脱ユビキチン化酵素であるCYLDは、NF-kBシグナル伝達を負に制御し、細胞増殖能, 免疫能等を調節すると考えられている。ヒトにおいては、CYLDのヘテロ生殖細胞系変異が皮膚腫瘍の原因となる抑制遺伝子としても知られている。これまでの研究で、家族性円柱症と考えられていた家系例において、CYLDに複合ヘテロ変異を同定しており、患者より樹立した線維芽細胞で、CYLDのタンパク発現が著減することを明らかにしている。
同定したCYLDの複合ヘテロ変異は新規変異であり、一過性強制発現系による機能解析で、その機能障害を検証する必要がある。そこで野生型ないしは変異型CYLDを発現ベクターを293T細胞で一過性発現させ、CYLDのタンパク発現を検討したところ、線維芽細胞での検討と同様に、CYLDタンパクの発現低下が認められた。次に変異型CYLDの質的評価のため、293T細胞に野生型プラスミド、各変異プラスミドを単独で、ないしは両変異プラスミドをNF-kBレポータープラスミドとともに共導入し、ルシフェラーゼアッセイを用いてTNFα刺激に対するNF-κB活性化への影響を検討した。その結果、野生型と比較してCYLD変異がTNFα誘導性のNF-kBのシグナル伝達を増強させることが明らかとなり、CYLDがNF-kBシグナル伝達を負に制御することが示された。
患者は、皮膚腫瘍のみならず胸腺の萎縮, CD4/8比の反転, B細胞欠損に伴う低ガンマグロブリン血症などを合併しており、免疫系への影響も示唆される。そこで患者の末梢血を用いてCYLD変異が免疫系細胞に及ぼす影響を詳細に検討した。リンパ球サブセット解析から、ナイーブ T細胞低下, メモリーB細胞低下, 形質芽細胞の低下, NKT細胞の欠損などが明らかとなった。その他にも、リンパ芽球増殖能の低下、レパトア解析からTCR, BCRの多様性の低下を示す所見が得られ、CYLDの量的低下が様々な免疫細胞に障害を及ぼす可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
患者が示す臨床症状はCyldノックアウトマウスの表現型と類似するものの、これまでヒトにおいてはヘテロ接合性変異による皮膚腫瘍発症の報告があるのみで、患者で認めた複合ヘテロ変異による報告例はない。そこで本年度はまず第一に同定された複合ヘテロ変異が病的意義を有するのか検証することにした。各変異体を用いた一過性強制発現系による機能解析で、NF-κBシグナル伝達に障害をきたしていることが明らかとなり、同定された変異が病的意義をもつという確証を得ることができた。
さらに本年度は、患者が示す様々な症状の詳細を明らかにするために、免疫系への影響を検証することにした。その結果、T細胞をはじめB細胞、NKT細胞など様々な免疫細胞で数的、質的障害をきたしていることが明らかになった。
また来年度に向けて、CYLDの役割である脱ユビキチン化能を検討する実験系を確立した。
したがって現在のところ、当初の計画通りおおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
CYLD変異が免疫系細胞に及ぼす影響をさらに検討する。具体的には、患者の末梢血単核球をCD4+ T細胞, CD8+ T細胞, CD19+ B細胞, CD14+ 単球などに分離した後、CD3, CD40L, TNF-αで刺激し、誘導されるIκBαの経時的リン酸と分解, RelAのリン酸化、およびサイトカイン（IL-6, IL-8）産生などを解析する予定であり、NF-κBシグナル伝達におけるCYLDの役割を明らかにする。
患者では免疫不全の症状以外に骨粗鬆症の症状を呈する。Cyld欠損マウスは、RANKLシグナルの過剰により破骨細胞の過形成が引き起こされ、骨粗鬆症に至る。そこで、患者骨髄由来単核球を用いて破骨細胞へと分化誘導させ、破骨細胞の形態を評価するとともに、破骨細胞の機能への影響を調べる予定である。
さらに、CYLD変異による脱ユビキチン化能への影響についても検証する。
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| Causes of Carryover |
患者の末梢血を用いて免疫系細胞に及ぼす影響の検討を行なったが、患者の受診のタイミングで解析を行っているため計画した全ての解析を行うことができなかった。そのため次年度に経費を使用し解析の続きを行う予定である。
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[Journal Article] IRAK4 Deficiency Presenting with Anti-NMDAR Encephalitis and HHV6 Reactivation2020
Author(s)
Nishimura Shiho、Kobayashi Yoshiyuki、Ohnishi Hidenori、Moriya Kunihiko、Tsumura Miyuki、Sakata Sonoko、Mizoguchi Yoko、Takada Hidetoshi、Kato Zenichiro、Sancho-Shimizu Vanessa、Picard Capucine、Irani Sarosh R.、Ohara Osamu、Casanova Jean-Laurent、Puel Anne、Ishikawa Nobutsune、Okada Satoshi、Kobayashi Masao
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Journal Title
Journal of Clinical Immunology
Volume: 41
Pages: 125～135
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] CARD9 deficiency in a patient with invasive infection due to Exophiala dermatitidis and the aymptomatic siblings2020
Author(s)
Yusuke Imanakal, Maki Taniguchil, Takehiko Doi, Maiko Shimomura, Miyuki Tsumura, Shuhei Karakawa, Kohsuke Imai, Tomohiro Morio, Anne Puel, Jean-Laurent Casanova, Osamu Ohara, Katsuhiko Kamei, Masao Kobayashi, Satoshi Okada
Organizer
19th biennial meeting of The European Society for Immunodeficiencies
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