2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of a zebrafish model of ribosomopathy for disease pathogenesis and drug discovery
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20K08160
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
剣持 直哉 宮崎大学, フロンティア科学総合研究センター, 教授 (00133124)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上地 珠代 宮崎大学, 医学部, 准教授 (10381104)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | リボソーム / 先天性貧血 / 疾患モデル / ゼブラフィッシュ / p53経路 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1）DBA患者のエクソーム解析で新たに遺伝子Xの変異が同定されたため、これが疾患原因であるかどうかの検証を進めた。まず、ゼブラフィッシュのオルソログを同定し塩基配列を決定した。この配列をもとにモルフォリノアンチセンスオリゴ（MO）を設計し、この遺伝子の機能を解析する準備を行なった。
2）独自に確立したゼブラフィッシュrps19変異体を用いてDBAモデルとしての妥当性を検証した。rps19変異体の初期発生と造血について調べたところ、初期胚において頭部の異常や尾部の屈曲などDBAとリンクする異常が認められた。また、ヘモグロビン染色で造血能を調べたところ、強い貧血を示すことが明らかになった。さらに、rps19変異体の受精卵にrps19 mRNAをインジェクションして前述の形態異常および造血能が回復することを確認した。以上の結果より、本変異体のDBAモデルとしての妥当性が確認された。
3）DBA発症とp53の発現との関連を検証するために、rps19変異体でp53の機能を阻害した。初めに、rps19変異体の受精卵にp53のMOをインジェクションしたところ、形態異常がほぼ完全に回復することを確認した。次に、rps19とp53の二重変異体を作製したところ、同様に形態の異常はほぼ完全に回復した。一方、造血能（貧血）に関してはMOと変異体のいづれの場合でも部分的な回復に留まった。p53パスウェイが形態異常に強く関与している一方、造血に関してはそれ以外の経路が関わっている可能性が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DBA患者で同定された新規の原因遺伝子の候補の解析をゼブラフィッシュを用いて進めている。DBAの原因遺伝子であるRPS19のゼブラフィッシュ変異体を作製し、これを用いた機能解析を進めている。すでに、p53経路の関与について新たな知見を得ている。以上のことから、研究課題はおおむね順調に進展していると判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）新規変異遺伝子の解析を進める。MOによるノックダウンおよびCRISPR/Cas9システムを用いた変異体の作製により原因遺伝子としての同定を目指す。
2）ゼブラフィッシュRPS19変異体を用いてオミックス解析を実施する。RPS19変異体のトランスクリプトーム解析およびポリソームmRNA解析を行い、DBAにおける翻訳異常と疾患発症との関連を検討する。
3）DBAに有効な化合物の探索をさらに進める。すでに実施した化合物スクリーニングで得られたヒット化合物について、その毒性や有効性について検討する。化合物の構造、反応性、類縁化合物などの既知情報をもとにin silicoで作用点を推測する。さらに、化合物の構造および既知化合物の活性データをもとに、ヒット化合物の最適化（構造変換）を行う。最適化を経た化合物はゼブラフ ィッシュおよび造血系ヒト細胞で薬効を検証する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナ対策による県外移動の禁止や自宅待機などにより旅費や謝金などの使用が当初の予定通りには進まなかった。また、実験にも制限がかかったため消耗品の購入も少なく物品費に余りが生じた。
使用計画：物品費として、研究を進めるための一般的な試薬・器具類の消耗品の他、ゼブラフィッシュの飼育に必要な物品、疾患モデルを作製するための合成オリゴなどの経費に使用する。謝金として、研究を効率的に進めるための実験補助およびゼブラフィッシュの飼育・管理を行う要員の雇用に使用する。
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