2021 Fiscal Year Research-status Report
乳児期発症先天性QT延長症候群における心Naチャネル複合体の役割に関する研究
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20K08170
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
竹内 大二 東京女子医科大学, 医学部, 准講師 (40328456)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
羽山 恵美子 東京女子医科大学, 医学部, 非常勤講師 (00349698)
古谷 喜幸 東京女子医科大学, 医学部, 非常勤講師 (10424673)
中西 敏雄 東京女子医科大学, 医学部, 研究生 (90120013)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | SCN5A / 早期発症LQTS / 疾患iPS細胞 / 心筋細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2021年度は、研究1「Nav1.5安定発現細胞を用い早期発症LQTS変異22種の電気生理学的解析」の実施のため、一昨年度に作製した18種のNav1.5変異遺伝子をもつ哺乳類発現プラスミドをそれぞれ293T細胞に導入し、ハイグロマイシン選択により、変異Nav1.5クローン株の樹立を進めた。
研究２の「Nav1.5安定発現株に制御タンパク質を共発現し電気生理の変化を検討」に関しては、2021年度は、Nav1.5とヒトα1シントロフィン、カベオリン3、Kir2.1の相互作用を検出する実験を進めた。昨年度クローニングしたα1シントロフィン、カベオリン3、Kir2.1を、N末にGFP融合蛋白質として発現する哺乳類発現型のプラスミドに挿入し、Nav1.5野生型及びR1623Q変異を恒常的に発現する293T細胞にそれぞれ導入した。すると、シントロフィン、カベオリン3の発現は、Nav1.5野生型293T細胞では顕著に亢進し、R1623Q変異型293T細胞では抑制された。
研究３のNav1.5の「R1623Q iPS細胞2検体由来iPS細胞を心筋細胞に分化し機能解析と生化学的分析を行う」に関しては、健常者並びに患者iPS細胞を浮遊法により心筋分化させ、発現遺伝子の変動やMED64による機能解析実験を進めた。その結果を「Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes with SCN5A R1623Q Mutation Associated with Severe Long QT Syndrome in Fetuses and Neonates Recapitulates Pathophysiological Phenotypes」というタイトルの論文にまとめ、MDPI Biology誌に投稿し、掲載された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「研究1：Nav1.5安定発現細胞を用い早期発症LQTS変異22種の電気生理学的解析」に必要な変異Nav1.5発現プラスミド18種を2020年度にまでに作製した。2021年度はこれらの変異Nav1.5発現プラスミドを293T細胞に導入し、恒常発現細胞株化を進めた。これまでに、2変異（R1623Q, E1784K）で細胞株化を完了し、電気生理実験を実施した。10変異については、クローン細胞株を複数得た。
「研究2：Nav1.5安定発現株に制御タンパク質を共発現し電気生理の変化を検討」のために、2021年度は、Naチャネルβサブユニット1, 2, 3, 4、α1シントロフィン、カベオリン3、Kir2.1 をAcGFP融合タンパク質として発現するプラスミドを作製した。これらをNav1.5安定発現株（野生型及びR1623Q変異型）及び293T細胞に導入し、GFP発現を観察した。複数のターゲット遺伝子では、293T細胞の場合と比べて、野生型Naチャネル細胞では発現の亢進、R1623QNaチャネル細胞では発現の抑制が観察された。Naチャネルとターゲット蛋白質間の蛋白質相互作用について、これらのNav1.5安定発現株が極めて有効であることが示唆された。
「研究３：R1623Q iPS細胞2検体由来iPS細胞を心筋細胞に分化し機能解析と生化学的分析を行う」に関しては、これまでの実験結果を総括して論文とし、MDPI Biology誌に投稿・掲載された。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究1の「Nav1.5安定発現細胞を用い早期発症LQTS変異22種の電気生理学的解析」の推進のために、2022年度は、残りのNav1.5変異安定発現293T細胞株の作製を続行し完成させる。これらの細胞を用いて、オートパッチクランプ法によるNa電流の測定を進めることにより、野生型と変異型のNav1.5の違いを電気生理学的に明らかにする。
研究２の「Nav1.5安定発現株に制御タンパク質を共発現し電気生理の変化を検討」の推進のために、2021年度は、Naチャネルβサブユニット1, 2, 3, 4、α1シントロフィン、カベオリン3、Kir2.1の制御候補遺伝子を、ピューロマイシン選択型哺乳類発現ベクター及び2遺伝子を共発現できるpIRES哺乳類細胞発現ベクターにサブクローニングし、Nav1.5と共発現するHEK293細胞の構築を進め、免疫沈降法を用いて、生化学的に変異Nav1.5との相互作用の検出を行う。
研究3の「R1623Q iPS細胞2検体由来iPS細胞を心筋細胞に分化し機能解析と生化学的分析を行う」は、2021年度に論文化できたので、実質完了しているが、引き続き、健常者とNaチャネル等の変異をもつ患者iPS細胞由来分化心筋細胞を用い、マルチ電極アレーシステム（MED64システム）を用いた電気生理学的特性の解析を行う。心電図のQT 間隔に該当する細胞外電位や拍動頻度を計測し、チャネルの変異によるQT 間隔延長などの評価を行う。薬理学的研究にもMED64 システムを用い、分化心筋細胞に様々なβ遮断薬・Na 遮断薬を種々の濃度で添加し細胞外電位等を測定し、その効果から患者に有効な治療薬の選択のための資料とする。
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[Journal Article] Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes with SCN5A R1623Q Mutation Associated with Severe Long QT Syndrome in Fetuses and Neonates Recapitulates Pathophysiological Phenotypes2022
Author(s)
Emiko Hayama, Yoshiyuki Furutani, Nanako Kawaguchi, Akiko Seki, Yoji Nagashima, Keisuke Okita, Daiji Takeuchi, Rumiko Matsuoka, Kei Inai, Nobuhisa Hagiwara, Toshio Nakanishi
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Journal Title
Biology
Volume: 10
Pages: 1-20
DOI
Peer Reviewed / Open Access
