2021 Fiscal Year Research-status Report
神経芽腫発がんにおける網羅的遺伝子破壊を用いたセカンドヒット遺伝子領域の探索
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20K08174
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| Research Institution | Research Institute for Clinical Oncology Saitama Cancer Center |
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Principal Investigator |
竹信 尚典 地方独立行政法人埼玉県立病院機構埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 研究員 (60392247)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
迎 恭輔 地方独立行政法人埼玉県立病院機構埼玉県立がんセンター(臨床腫瘍研究所), 臨床腫瘍研究所, 研究員 (60793974)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | iPS / 発がん / 細胞分化 / 神経芽腫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
小児がんである神経芽腫は、神経堤細胞に由来し、交感神経への分化の過程で発生する、悪性固形腫瘍である。神経芽腫の悪性化と相関する遺伝子異常はMYCN遺伝子の増幅であるが、悪性の神経芽腫においても1/3程度にしか存在しない。我々はヒトiPS細胞を神経堤細胞に分化する実験系を用いて、正常細胞から神経芽腫細胞を作り出すことを試みており、これまでに、頭部型と尾部型の2つのタイプの神経堤細胞へ分化が可能であることを明らかにした。さらにiPS細胞から分化させた神経堤細胞へのMYCN遺伝子の導入を行い、神経芽腫の原因遺伝子の一つであるMYCNの高発現細胞を得ることに成功した。これまでにPHOX2B, SOX10などの神経芽腫の根源となる細胞のマーカーの発現が上昇していることも確認した。
それらの神経芽腫の根源となりうる細胞に対して、全遺伝子を標的とする複数のCRISPRライブラリを導入する。導入した細胞は、特定の遺伝子もしくは、複数のがん抑制遺伝子に変異が導入された際に、強い増殖能力と細胞死に対する抵抗性を獲得すると考えられる。
本研究では、それらの細胞を軟寒天中でのコロニー形成、免疫不全マウスでのスクリーニングなどの複数の方法を通じて選び出す。選び出し多細胞は、どのような遺伝子が神経芽腫を形成するための決定的なセカンドヒットとなっているかを次世代シークエンスを用いて明らかにし、パスウェイ解析などを介して、新たな治療標的の同定へつなげる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
分担研究者によって先行研究を参考に、iPS細胞から神経堤細胞への分化方法が確立した。それらの細胞にMYCNを導入し、何らかの追加の異常を惹起するため、軟寒天中での形質転換を引き起こし、免疫不全マウスに導入したところ、神経芽腫ではなく骨分化が促進された。これらの結果は現在論文を作成している。神経芽腫が発生すると考えられる尾部神経堤細胞への分化は、いまだに安定していないため、頭部神経堤細胞を用いた研究に着手している。
一方で、gRNAライブラリプラスミドに関しては、2種類のプール、4ライブラリを入手して増幅を行った。増幅したプラスミドを用いてレンチウイルスを作成し、神経芽腫細胞株への導入を行ったところ、puromycin耐性の細胞プールが獲得できたため、プラスミドおよび手法の検討は十分であると判断した。この細胞プールを用いてdependency assayを行って、薬剤への感受性に関する遺伝子の探索も同時に行っていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度に購入および増幅が完了した3プールとコントロールのsgRNAライブラリを発現するレンチウイルスを産生する。安定して分離増殖できる頭部神経堤細胞を分担研究者と用意し、レンチウイルスを感染させてpuromycin耐性の細胞を選択する。それらの細胞は複数のアッセイに用いられるよう保存した後、がん化の指標となる軟寒天培地中での増殖、ヌードマウスまたはSCIDマウスの皮下へ導入し、腫瘍形成能を獲得した細胞を増殖させる。
それらの細胞は、一部を平板培養で培養するとともに、軟寒天培地またはマウスへ再度戻すことによって、悪性化の高い細胞を分離することができる。それらの細胞を集め、sgRNAを検出するプライマーを用いて次世代シークエンスを行い、導入されたsgRNAをランキングして、発がんと破壊された遺伝子の依存の強さを明らかにする。同定された遺伝子のうち、既知のがん抑制遺伝子をできるだけ除いた上でそれらに対する個別のsgRNAを作成し、細胞へ導入して、がんの悪性化に関わるメカニズムを、マイクロアレイ等を用いた複数の解析方法で明らかにする。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍で届かない物品があった。また、国際学会参加予定がなくなった。
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