2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of fetal therapy of congenital diaphragmatic hernia by intra-amniotic injection of exosomes derived from mesenchymal stem cells
| Project/Area Number |
20K08188
|
|---|
| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
|---|
Principal Investigator |
古川 泰三 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20515291)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松田 修 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00271164)
岸田 綱郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00370205)
東 真弓 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10380453)
馬庭 淳之介 国立研究開発法人国立がん研究センター, 中央病院, 医員 (20847222)
坂井 宏平 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員講師 (30515292)
田尻 達郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80304806)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | 間葉系幹細胞 / エクソソーム / 先天性横隔膜ヘルニア / 羊水腔投与 / ラット |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
先天性横隔膜ヘルニア(CDH)には近年，新生児呼吸管理の進歩より救命率は目覚ましく改善している.一方、極度の肺低形を伴う最重症例においては根治手術に到達以前に失っている現状があり,胎児期における肺成熟を促す治療方法が希求されている.我々はこれまでにCDHに対する新規胎児治療の開発に向け,ニトロフェンCDHモデルラットを用いて間葉系幹細胞(MSC)を羊水腔投与することにより,CDH胎仔において肺成熟が促されることを報告した.次の段階として, MSCの作用機序を 解明するためMSCが分泌するエクソソーム(MSC-エクソソーム)の効果を検討する.また，MSC-エクソソームに含有されている代表的なgrowth factorの肺成熟に与える影響を比較検討し， MSCが肺成熟を促すメカニズムの解明を目指す.MSCの直接作用による影響も考慮し、 パラクライン作用単独での効果と比較検討することで、最適な投与方法についても検討する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コラーゲン膜の表面または裏面にMSC 10,000/平方センチメートル播種し，MSC培養培地で一晩培養する.培地を無血清のDMEM/F-12培地に入れ替え，正常妊娠SD ラットまたはニトロフェン投与妊娠SDラットより胎生13.5日目または胎生14.5日目胎仔を摘出し，胎仔より肺芽を採取して，コラーゲン膜上で気液界面培養を72 時間行った.24時間毎に肺芽の状態を評価し，凍結保存する.MSCがない培養群をControl群，MSCと接着した状態の培養群をCo-culture群，MSCと非接触状態の培養群をSeparate-culture群とした.組織学的評価として肺芽の表面積と終末肺芽数の増加率を比較検討した.正常妊娠SDラット胎仔(胎生13.5日目または胎生 14.5日目)由来の肺芽培養ではContorol群とCo-culture群より摘出した肺芽の培養では表面積の増加率で有意差を認めたが，Separate-culture群に関しては有意差を認めなかった.培養条件の変更に加え、MSCの播種数を一定に保つためにMesh insertを用いた気液界面培養も行なったが、やはり形態学的評価では有意差を認めず、標的液性因子の定量評価には至っていない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
肺芽培養の検討内容としては，MSCの培養条件の改善を検討している.組織学的評価を行う上で有用であった気液界面培養での、至適細胞数および培養日数を検討していくのと並行し、通常の培養での評価も同時に行う予定である。気液界面培養では、細胞が横方向への成長が促されるため、形態学的な分化状況の確認が容易であるが、一方培養液に触れている部分が少なく、growth factorの分泌も少量となるため、培養条件の抜本的見直しが必要であると考えられた。その条件下での，培養肺芽中のgrowth factor(FGF-10，FGF-9，Wnt7b，BMP4，SHH ，VEGF-α)の発現をRT-PCRで評価す る.また，Western BlottingやELISA法により肺芽培養の培養上清中のMSC-エクソソームのgrowth factorのタンパク解析検討している.
|
| Causes of Carryover |
令和3年度に、growth factorを調べる工程まで進め、定量的評価を行う予定であったが、培養条件の抜本的見直しが必要となり、当初予定していた工程まで進めず，FGF-10，FGF-9，Wnt7b，BMP4，SHH ，VEGF-αなどの抗体を購入することがなかったため消耗品の使用量が少なくなった.令和4年度は、まず形態学的評価にて有意な差が確認できるよう、培養条件の変更が余儀なくされており、今以上の培養薬剤の追加や、必要に応じて抗体公認を行っていくため、次年度使用額が多くなった。
|
