肺胞内免疫環境の再構築と微小血管障害の改善は早産児肺障害の新規治療法となり得るか

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08192
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 中西 秀彦 北里大学, 医学部, 教授 (70528207)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北原 秀治 東京女子医科大学, 医学部, 特任准教授 (40510235)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 慢性肺疾患 / 微小血管障害

Outline of Annual Research Achievements

肺胞および肺胞微小血管の発達が未熟な超早産児では、出生後の高濃度酸素投与や人工呼吸管理が要因で、肺胞微小血管障害を引き起こし、慢性肺疾患（chronic lung disease; CLD）へと進行する。本研究の目的は、CLDにおける肺胞微小血管障害とその再生過程における免疫細胞の動向やそれら肺胞構成細胞との相互作用について解析することである。主要研究項目は、① 肺胞障害および再生過程に関与する免疫関連遺伝子の同定と発現パターンの解析、② 肺胞構成細胞と免疫細胞との細胞間相互作用に関する免疫組織学的解析、③ 肺胞構成細胞の超微形態解析による免疫細胞活性に関連する抗原の発現部位の同定、であるが、本年度は、CLD、CLD回復期、回復期再生モデルから採取した肺組織の全RNA（total RNA）用いて免疫関連遺伝子の動向を網羅的に解析した。

解析方法は、理化学研究所が開発したCAGE-seq法を用いた。カットオフの方法は、数万に及ぶ遺伝子データ母集団のうち、各遺伝子の発現変動が、高濃度酸素で4倍以上の上昇を示したものを示すもの（すなわちLogFC>=2）、かつ、治療群で4倍以下の減少を示したもの（すなわちLogFC<=-2）を閾値として設定した。その結果、Sh2b2、Steap1、Grin2c、Gata4、Cxcl13、Tff2、Tnf、Bpifa1、Cxcl9、Oas2、Ccl2、Muc5ac、Ptger3、Ctsg、Ccl21a、Igkv8-30といった免疫系や恒常性にかかわる遺伝子が関連遺伝子として挙がった。さらに上記遺伝子に加え、ケモカイン遺伝子（CxCl2、3、5、10、Ccl1、7、18、20、24）をピックアップし、改めてプライマー設計後、リアルタイムPCRを施行したところ、結果の再現を確認することができた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

令和2～3年にかけて、世界的なSARS-CoV-2による感染流行の影響を受け、遺伝子関連の解析サポートを受注依頼している会社が、医療現場へのPCR検査提供のため、一時的に解析サポートを中止していることもあり、遺伝子解析結果については、予定よりも遅れて進行している。また感染防止策のために一時的な研究施設内での物流停止、研究活動制限、在宅勤務の推奨などのCOVID-19対策の影響や、各種研究会や学会がほぼ中止となってしまったことを受け情報交換の場が減少したことも研究の進捗状況が遅れている要因の一つとなっている。

過去の研究で使用した固定肺組織を用いて、CD31、αSMAの免疫組織染色のコンディションの調整、オリンパス・カラーカメラ DP27を用いて肺組織HE染色標本の肺胞構造の定量化のための計測調整を行っている。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、COVID-19の動向に注視しつつ、以下の研究を無理なく進める予定である。
１．多重免疫染色による肺胞構成細胞-免疫細胞間の相互作用の3次元的解析：　血管内皮細胞（CD31、CD34、CD105等）や、血管平滑筋(αSMA)、肺胞上皮細胞（Pro-SPC）と、マクロファージ（F4/80、LYVE-1）、T細胞（CD3、CD4、CD8）などの細胞のマーカーを用いて多重蛍光免疫組織染色を施行し、共焦点レーザー顕微鏡等を用いて3次元的に観察する。
２．フローサイトメトリーを用いて各モデル新生仔マウス肺におけるマクロファージの活性化の動向を比較：　CLDに関連する免疫細胞の経時的動向を追うために、各モデル新生仔マウス肺組織をコラゲナーゼ処理にて単細胞化した調整液を作成後、抗F4/80抗体、M1型（表面抗原：CD80/86、CD11c）とM2型（表面抗原：CD206）の特異抗体を用いて、M1/M2発現比をフローサイトメトリーで計測する。事前にテストマウスを用いて手技確立のための検証実験を行う予定である。
3．同定免疫関連遺伝子の障害・再生過程における経時的な発現量、発現パターンの解析：　免疫関連遺伝子をピックアップし、特異的プライマーを用いたリアルタイムPCRにより、CLD、回復期、回復期再生モデルにおけるそれら関連遺伝子の発現量、発現パターンを解析する。特にCLDモデルでは、出生後、暴露後4、7、10、14日目、回復モデルでは、回復直後、4、7日目と、経時的な推移を解析する。

Causes of Carryover

理由：　次年度繰越金の発生に関しては、令和2～3年にかけての世界的なSARS-CoV-2による感染流行の影響を受け、感染防止策のために一時的な研究施設内での物流停止、研究活動制限、在宅勤務の推奨、各種研究会や学会の中止等により、研究の進捗が遅れたことが原因である。ただし必要でなかったわけではなく、次年度においては、COVID-19の動向に注視しつつ、研究を進めていく予定である。
使用計画：　本研究では、電子顕微鏡を用いた微細構造レベルの解析が重要な位置を占める。また検索の過程においては、肺胞壁を構成する細胞群を明らかにするために、それらの可視化のための抗体をはじめとした試薬類が必須である。具体的な消耗品費としては、実験用動物（ ICRマウス他）の購入費および飼育費、試薬類には、培養用血清、免疫染色用の抗体、分子組織化学用の制限酵素、プローブ標識キット、標的遺伝子プライマー、PCR用試薬、電子顕微鏡用には、樹脂包埋キット、超薄用ダイヤモンドナイフ、画像解析用のコンピューター関連品、また、プラスティック器具類、論文別刷代などの諸費用が含まれる。その他、学外研究者との情報交換のための旅費、ならびに成果発表のための学会参加費などの旅費( 国内外を含む)、印刷費( カラー印刷)、論文投稿費用などが経費に含まれる。