肺胞内免疫環境の再構築と微小血管障害の改善は早産児肺障害の新規治療法となり得るか

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08192
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 中西 秀彦 北里大学, 医学部, 教授 (70528207)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北原 秀治 東京女子医科大学, 医学部, 特任准教授 (40510235)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 免疫細胞 / 早産児慢性肺疾患 / 肺胞修復

Outline of Annual Research Achievements

肺胞および肺胞微小血管の発達が未熟な超早産児では、出生後の高濃度酸素投与や人工呼吸管理が要因で、肺胞微小血管障害を引き起こし、慢性肺疾患（chronic lung disease; CLD）へと進行する。本研究の目的は、CLDにおける肺胞微小血管障害とその再生過程における免疫細胞の動向やそれら肺胞構成細胞との相互作用について解析することである。前年度に、フローサイトメトリーを用いてCLD、CLD回復期、回復期再生モデル肺におけるマクロファージの活性化の動向を比較するための予備実験を実施したが、サンプルとして肺組織全体を使用した場合、マクロファージ以外の細胞成分が多すぎるためかマクロファージのみを正確に見分けることが困難であったため、抗体磁気ビーズを使用してマクロファージのみを分離してからM1、M２を見分けることに方針を変更した。そしてその前段階として抗F4/80抗体を用いた免疫組織染色で、正常コントロール（ルームエア21日間）、CLD、CLD回復期、回復期再生モデルの4群の新生仔マウス肺組織を用いて、マクロファージの局在を確認した。それぞれの肺組織に抗原賦活化処理をした後、抗F4/80抗体を4℃オーバーナイトで暴露後に明視野でDAB発色を実施した結果、全ての群における肺胞壁に免疫活性を有する細胞を認めた。またCLD、CLD回復期、回復期再生モデル肺では、正常コントロールと比較して多くの陽性細胞数を認めた。現在、これらマクロファージがM1型かM2型かを鑑別するために、M1の指標となるiNOS、M2の指標となるArginase1を抗原とする抗体を用いて、免疫染色を実施しており、最終的には蛍光染色による二重染色を各群で実施することによって、肺胞修復メカニズムを解明していく予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

令和4～5年にかけても引き続きSARS-CoV-2による感染流行の影響を受け、研究活動制限、在宅勤務の推奨などのCOVID-19対策の影響や、各種研究会や学会の開催が中止となってしまったことを受け情報交換の場が減少したことも研究の進捗状況が遅れている要因の一つとなっている。また当初予定していた新生仔マウス肺組織を用いたフローサイトメトリーを用いた免疫細胞の動向実験では、マクロファージ以外の細胞成分が多いことにより特異的にM1、M2を認識することが難しいことがわかったことを受けて、計画を変更して、固定肺組織を用いて、抗F4/80抗体、抗iNOS抗体、抗Arginase1抗体を用いた免疫組織染色を実施することで、マクロファージの局在および肺障害からの修復過程の動向を追うこととした。具体的にはM1の指標である抗iNOS抗体、M2の指標である抗Arginase1抗体とマクロファージの指標である抗F4/80抗体の蛍光染色による二重染色を実施し、各群の単位面積あたりのM1とM2それぞれの陽性細胞数比率を調べる予定である。またCD31、αSMAの免疫組織染色結果より、各群の肺胞壁組織における血管内皮細胞、血管平滑筋細胞の占める割合や、肺組織HE染色標本を用いて肺構造の定量化を、オリンパス・カラーカメラ DP27を用いて実施し、現在解析中である。

Strategy for Future Research Activity

最終年度は、以下の研究を引き続き進める予定である。
1．正常コントロール（ルームエア21日間）、CLD、CLD回復期、回復期再生モデルの4群の新生仔マウス肺組織を用いて、抗F4/80抗体による免疫組織染色を実施し、肺胞実質単位面積あたりの免疫活性陽性細胞数を算出し、定量化する。
2．M1の指標である抗iNOS抗体、M2の指標である抗Arginase1抗体とマクロファージの指標である抗F4/80抗体の蛍光染色による二重染色をそれぞれ実施し、前述した4群間における肺胞単位面積あたりに存在するマクロファージにおけるM1、M2の比率を算出する。
3．可能であれば、新生仔マウス肺組織からマクロファージのみ分離可能な抗体磁気ビーズを用いて、各群の肺組織からマクロファージを抽出し、フローサイトメトリーを用いて各モデル新生仔マウス肺におけるマクロファージの活性化の動向を比較する。CLDに関連する免疫細胞の経時的動向を追うために、各モデル新生仔マウス肺組織をコラゲナーゼ処理にて単細胞化した調整液を作成後、抗F4/80抗体、M1型（表面抗原：CD80/86、CD11c）とM2型（表面抗原：CD206）の特異抗体を用いて、M1/M2発現比をフローサイトメトリーで計測する。

Causes of Carryover

次年度繰越金の発生に関しては、令和4~5年にかけてのSARS-CoV-2による感染流行の影響を受け、感染防止策のために一時的な研究施設内での物流停止、研究活動制限、在宅勤務の推奨、各種研究会や学会の中止等により、研究の進捗が遅れたことが原因である。ただし必要でなかったわけではなく、次年度からSARS-CoV-2の5類移行に伴い、研究を進めていく予定である。本研究では、肺胞壁を構成する細胞群を明らかにするために、それらの可視化のための抗体をはじめとした試薬類が必須である。具体的な消耗品費としては、実験用動物（ ICRマウス他）の購入費および飼育費、試薬類には、培養用血清、免疫染色用の抗体、分子組織化学用の制限酵素、プローブ標識キット、標的遺伝子プライマー、PCR用試薬、電子顕微鏡用には、樹脂包埋キット、超薄用ダイヤモンドナイフ、画像解析用のコンピューター関連品、また、プラスティック器具類、論文別刷代などの諸費用が含まれる。その他、学外研究者との情報交換のための旅費、ならびに成果発表のための学会参加費などの旅費( 国内外を含む)、印刷費( カラー印刷)、論文投稿費用などが経費に含まれる。