Elucidation of the mechanism of genotype-phenotype correlation in cardiomyopathy using disease-specific isogenic iPS cells

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08193
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 古道 一樹 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (10338105)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 芝田 晋介 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 訪問教授 (70407089) ; 湯浅 慎介 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (90398628)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 心筋症 / 左室心筋緻密化障害 / 心筋発生 / iPS細胞

Outline of Annual Research Achievements

今回我々は、サルコメア構造タンパクをコードするMYH7遺伝子に、表現型の異なる肥大型、拡張型および左室心筋緻密化障害の各心筋症を引き起こす3種類の異なる変異を導入したiPS細胞を作製し、表現型の差異が生じるメカニズムの解明を目指した。研究代表者はこれまでに、疾患発症メカニズムの解明を目指した先行研究で、胎生期の心筋緻密層における、胎児心筋細胞の増殖抑制が、正常な緻密層形成を阻害し、心筋緻密化障害が形成されるという病態の一端を解明した。興味深いことに、左室心筋緻密化障害特異的なMYH7変異を導入したiPS心筋細胞は、サルコメア構造の形成が重篤に障害され、さらに分化誘導開始後2週間の心筋細胞を用いた網羅的遺伝子発現解析で、左室心筋緻密化障害および拡張型心筋症の疾患特異的変異を有する心筋細胞では、正常コントロール心筋細胞に比して細胞周期の異常が示唆される結果が得られた。しかし、その後の詳細な分析で、これらの心筋症特異的iPS心筋細胞では、細胞増殖能がむしろ亢進する現象が確認され、この結果は研究代表者の唱える、胎児心筋細胞の増殖障害説と相反する結果となった。TBX20変異を原因とする病態と異なり、サルコメア構造タンパクの特異的な領域に対する変異が、細胞周期を亢進させるという報告はこれまでになく、サルコメア構造の構築障害が細胞成熟性に負に影響し、未熟心筋に起因する緻密層構築障害および機能障害につながる可能性が考えられた。立体的な心筋層構築をiPS細胞を用いて評価するため、さらに我々は心筋オルガノイド作製を試み、その形成に成功した。今後さらにiPS心筋細胞をsingle cell レベルおよび3次元的な立体レベルで詳細な形態形成および遺伝子制御機構を解析することにより、胎生期の発生に関する細胞制御を司る、サルコメア構造タンパクの新たな役割を明らかにしていく糸口となる可能性が期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

MYH7遺伝子変異を導入した左室心筋緻密化障害特異的iPS細胞由来心筋細胞では、サルコメアが細かく分断されている様子が観察された。細胞内カルシウム動態をカルシウムイメージングを用いて検討した際には、左室心筋緻密化障害特異的iPS心筋細胞において、Ca濃度変化に障害が認められた。さらに、次世代RNAシークエンスを用いた網羅的遺伝子発現解析では、左室心筋緻密化障害特異的iPS細胞由来心筋細胞では、細胞周期の調整関連遺伝子発現に異常が認められた。昨年度までの解析では、細胞周期抑制に働く因子の変化に注目したが、実際の細胞の挙動を詳細に観察したところ、MYH7変異導入心筋細胞では、細胞増殖能がコントロール心筋細胞に比して、亢進していることが明らかとなった。この結果は、研究代表者が解明したTBX20変異により発症する左室心筋緻密化障害の発症メカニズムと反する現象である。過去の動物実験に基づく、左室緻密層の形成異常は、細胞周期の亢進、低下どちらのパターンも報告されており、サルコメア構造タンパクの異常を原因とする左室心筋緻密化障害の発症機序として、細胞周期の異常亢進が関与する可能性が考えられた。細胞レベルでの形態形成異常の評価には限界があり、実際に心筋細胞増殖能亢進がどのように心筋層の形態形成に障害を及ぼすかを検討するため、Drakhlis Lらの方法(Nat Biotechnol. 2021;39(6):737-746.)に基づき、iPS細胞由来心筋オルガノイドの作成を試みた。現在、コントロールおよび左室心筋緻密化障害特異的iPS細胞からオルガノイド形成が可能なことを確認している。
今後、さらに疾患発症に関わるシグナルについての解析を進めるとともに、オルガノイドを用いた3次元的心筋層構築過程の観察を可能とし、疾患特異的表現型の形成につながる分子機構の解明を目指す。

Strategy for Future Research Activity

疾患発症メカニズムを分子生物学的に明らかにするため、次世代RNAシークエンスを用いた網羅的遺伝子発現解析を、心筋分化誘導開始後2週間の幼若な心筋細胞を用いて検討した。昨年度の時点での解析では、拡張型心筋症特異的iPS細胞由来心筋細胞では、心筋収縮機能に関わる遺伝子群の発現に異常が目立ち、左室心筋緻密化障害特異的iPS細胞由来心筋細胞では、細胞周期の調節機構に強い異常が認められる可能性が疑われた。その後の詳細な解析で、左室心筋緻密化障害特異的心筋細胞の細胞増殖能が亢進していることが明らかとなり、細胞の成熟障害が根底に存在する可能性が疑われている。遺伝子制御機構の核となる分子制御機構をさらにバイオインフォマティックス的解析を発展させ明らかにするとともに、細胞レベルでは観察困難な3次元構造形成に関する情報を得るために、心臓オルガノイド作製を試みている。現在までにコントロールiPS細胞および左室心筋緻密化障害特異的iPS細胞より心臓オルガノイド形成が可能であることを確認できており、今後オルガノイドの形態形成過程における細胞周期異常の与える影響を解析する。プレリミナリーな結果としては、細胞レベルの解析結果と同様に、左室心筋緻密化障害特異的心臓オルガノイドの心筋層では、細胞周期が亢進している現象が確認されており、心筋形態の異常につながる発生過程をオルガノイドで再現する。これらの情報を得ることで、左室心筋緻密化障害の発生過程における胎児心筋の細胞周期異常が実際の病態の主幹となることを証明するとともに、細胞周期を調節することにより、心筋形態の改善が可能となるか検討し、将来の薬物療法につながる知見を得ることを目指す。

Causes of Carryover

ウクライナ危機に伴う、試料の欧州生産供給が不安定となり、特にiPS細胞培養、心筋分化、オルガノイド形成に不可欠となるマトリゲルの供給が完全にストップしてしまったため、確保していた予算で購入することができず、次年度、供給が回復次第購入する予定である。
また、学会参加、発表用に計上している旅費については、コロナの影響から繰越す予定である。