神経芽腫の自然退縮・分化に関わる新規予後良好分子マーカーの検討と治療応用

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08212
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 家原 知子 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20285266)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柳生 茂希 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10572547) ; 吉田 秀樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10643546) ; 菊地 顕 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (40453104) ; 宮地 充 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40584983) ; 土屋 邦彦 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (90381938)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 神経芽腫 / 分化

Outline of Annual Research Achievements

神経芽腫患者からの初診時血清および腫瘍組織より抽出したmicroRNA（miRNA）を用いた網羅的発現解析と、神経芽腫細胞株を分化させたexsosomeから抽出したmiRNAとの相互解析から、新たな非侵襲的な神経芽腫の分化特異的診断、及び予後良好マーカーの検索を目的として、以下の基礎的研究を行った。当院での神経芽腫患者からの血清14検体（低リスク６検体、中間リスク2検体、高リスク6検体）を用いて、miRNAアレイは3D-Gene　miRNA Oligo chipを用い、受託サービスを利用し、低リスクと高リスクで優位に差があり、かつ低リスクで優位に発現しているmiRNA候補を絞りこみ、さらに、連結した患者データー（年齢、病理,病期、MYCN増幅、11q LOH）との比較検討と、検証を行い候補4種に絞りこんだ。これらのmiRNAについて、miRBaseなどを用いて、関連遺伝子を検索している。関連遺伝子の検索ではMYCN遺伝子をはじめとする、神経芽腫のがん関連遺伝子との関与が示唆されているが、これまで加工の報告例や他の疾患での情報が乏しいmiRNAも含まれている。また、これらのmiRNA候補にういては、複数の神経芽腫細胞株および細胞上清での候補miRNAの発現を検索している。これらのmiRNAの機能解析研究については、まだ準備段階であるが、来年度に向けて神経芽腫細胞株を利用して、実施予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

低リスク神経芽腫で優位なmiRNA候補を概ね絞りこむことができた。細胞株での検証が遅れているが、今年度前期では終了できる予定である。

Strategy for Future Research Activity

候補miRNAのバリデーションを下記の通り行うとともに、分化退縮のマーカーである場合は、細胞株では低発現が予測されるので、細胞株にレチノイン酸を投与することで分化を促進して、候補miRNAの発現を検討するなどの方策を加える予定である。
神経芽腫患者血清に対応した腫瘍検体を用い候補miRNAの発現量を確認する。さらに当教室で樹立した15株を含む神経芽腫細胞株27株、正常細胞（リンパ球、血管内皮細胞、成熟星状細胞およびグリア前駆細胞）での細胞内および培養上清から抽出したexsosome内miRNAの発現量を確認する。
また、神経芽腫細胞株におけるmiRNAの機能解析として、神経芽腫細胞株に候補miRNAのmiRNA mimic、miRNA inhibitor、またはpre-miRNA発現ベクターを導入、増殖（WST8 assay）、転移能（wound-healing assay, invasion assay）、分化（免疫染色）への影響を確認する。