2021 Fiscal Year Research-status Report

神経芽腫の自然退縮・分化に関わる新規予後良好分子マーカーの検討と治療応用

Research Project

Project/Area Number	20K08212
Research Institution	Kyoto Prefectural University of Medicine
Principal Investigator	家原知子京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20285266)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	柳生茂希京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10572547) 吉田秀樹京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10643546) 菊地顕京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任講師 (40453104) 宮地充京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40584983) 土屋邦彦京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (90381938)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	神経芽腫 / 分化
Outline of Annual Research Achievements	神経芽腫は、MYCNなどの悪性度のマーカーは知られているが、自然退縮するマーカーは知られていない。本研究の目的は、神経芽腫患者の初診時血清より抽出したmiRNAを用いて網羅的に発現解析を行うとともに、神経芽腫細胞株を分化させたexsosomeから抽出したmiRNAとの相互解析から、①新たな非侵襲的なNBの分化特異的診断及び予後マーカーを検索することである。②さらにその候補miRNAの機能解析を行うことで新たな治療標的の検討を行い検証する。当院での神経芽腫患者からの血清14検体（低リスク６検体、中間リスク2検体、高リスク6検体）を用いて、miRNAアレイは3D-Gene　miRNA Oligo chipを用い、受託サービスを利用し、低リスクと高リスクで優位に差があり、かつ低リスクで優位に発現しているmiRNA候補を絞りこみ、さらに、連結した患者データー（年齢、病理,病期、MYCN増幅、11q LOH）との比較検討、検証を行い候補4種に絞りこんだ。これらのmiRNAが神経芽腫の分化退縮のマーカーである場合は、細胞株では低発現が予測され、細胞株にレチノイン酸を投与することで分化を促進して、候補miRNAの上昇が期待できると考えた。神経芽腫細胞株のレチノイン酸を用いた分化モデルを作成し、分化モデルにおいて、腫瘍細胞および上清において、これらのmiRNAがどのような変化を来すかを検証した。その結果、2種類のmiRNAが分化モデルによって、上清中に上昇することを確認した。この候補miRNAがExosome 内に存在するのかについて、細胞培養の上清を用いてExosome を回収するシステムを構築しつつある。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 神経芽腫細胞株のレチノイン酸を用いた分化モデルを作成し、分化モデルにおいて、腫瘍細胞および上清において、これらのmiRNAがどのような変化を来すかを検証した。その結果、2種類のmiRNAが分化モデルによって、上清中に上昇することを確認した。この候補miRNAがExosome 内に存在するのかについて、細胞培養の上清を用いてExosome を回収するシステムを構築しつつある。
Strategy for Future Research Activity	候補2種類のmiRNAのバリデーションを下記の通り行う。当教室で樹立した15株を含む神経芽腫細胞株27株、正常細胞（リンパ球、血管内皮細胞、成熟星状細胞およびグリア前駆細胞）での細胞内および培養上清から抽出したexsosome内miRNAの発現量を確認する。さらに複数の神経芽腫患者血清に対応した腫瘍検体を用い候補miRNAの発現量を確認する。この候補miRNAがExosome 内に存在するのかについて、細胞培養の上清を用いてExosome を回収するシステムを構築し、確認する。また、神経芽腫細胞株におけるmiRNAの機能解析として、神経芽腫細胞株に候補miRNAのmiRNA mimic、miRNA inhibitor、またはpre-miRNA発現ベクターを導入、増殖（WST8 assay）、転移能（wound-healing assay, invasion assay）、分化（免疫染色）への影響を確認する。