2022 Fiscal Year Research-status Report

尿中スプライシング産物をバイオマーカーとした筋ジストロフィー治療評価系の検証

Research Project

Project/Area Number	20K08221
Research Institution	Hyogo Medical University
Principal Investigator	田中靖彦兵庫医科大学, 医学部, 非常勤講師 (20595045)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	李知子兵庫医科大学, 医学部, 講師 (10596042) 下村英毅兵庫医科大学, 医学部, 講師 (30441273) 竹島泰弘兵庫医科大学, 医学部, 教授 (40281141) 奥野美佐子兵庫医科大学, 医学部, 助教 (60646553)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	Duchenne型筋ジストロフィー / エクソンスキッピング / extracellular RNA / アンチセンスオリゴヌクレオチド
Outline of Annual Research Achievements	Duchenne型筋ジストロフィー(Duchenne Muscular Dystrophy：DMD)に対し、エクソンスキッピングを誘導する治療法の臨床への応用が開始された。「DMDに対するエクソンスキッピング誘導治療」は本邦でも迅速承認を受けており、現在最も実績と有効性のある根治療法といえる。しかし、細胞レベルにおいてアンチセンスオリゴヌクレオチド（Antisense Oligo Nucleotide: AS-Oligo）によるエクソンスキッピング効率には差があることが想定されており、個々の症例における有効性を評価するバイオマーカーが無いことが治療を推進する上で妨げとなっている。申請者は尿中に排泄されるmRNAが筋組織におけるスプライシングを反映する可能性を着想した。そして、患者尿由来mRNAを解析することにより、個々の症例におけるエクソンスキッピング誘導治療の有効性を非侵襲的かつ簡便に評価するシステムを構築可能と考えた。本研究の成果により、臨床応用が開始されようとしているエクソンスキッピング誘導治療が大きく推進するものと期待される。2022年度は、血中RNA（extracellular RNA: exRNA）におけるスプライシングパターンを解析するシステムの構築とともに、AS-oligo投与症例におけるジストロフィンRNAスプライシングパターンの解析を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 理由筋細胞RNAおよびexRNAにおけるスプライシングパターンを解析するシステムの構築を行った。各症例ごとにReverse transcription (RT) -PCR法によって、ジストロフィンmRNAを増幅し、スプライシングを解析系を確立した。尿よりRNAを抽出するシステムの構築を進めているが、回収率が悪くシステムの構築が進んでおらず、血中RNAの解析を並行して進めているため。
Strategy for Future Research Activity	血中および尿中exRNA解析システムの構築を進めるとともに、筋細胞RNAおよび血中・尿中exRNAにおけるスプライシングパターンが関連していることの検証を行う。その上で、DMD患者に対しAS-oligoによるエクソンスキッピング誘導を行った際の、血中・尿中exRNAにおけるスプライシングの検討を行う。また、DMDモデルマウスであるmdxマウスに対しAS-oligoによるエクソンスキッピング誘導を行い、経時的に筋mRNAと血中・尿中exRNAの解析し、両者が相関することを検証する。
Causes of Carryover	reverse transcription (RT)-PCRによる尿中exRNA解析システム構築が進んでおらず、予定よりも試薬の購入量が少なく、また、コロナ禍のため、研究打ち合わせなどの旅費を使用することがなかったため、次年度使用が生じた。現在、血中exRNA解析システムの構築を並行して進めており、両システムにより、次年度使用研究費により、当初の実験計画を遂行していく予定である。