Search for the regulatory mechanism of mitochondria by microRNA and long noncoding RNAs

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08266
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 水野 洋介 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (30406532)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ミトコンドリア / 非コードRNA / エクソソーム / マイクロRNA

Outline of Annual Research Achievements

これまでに、特定のミトコンドリア関連遺伝子をCRISPR/CASでノックアウトしたヒト線維芽細胞と、さらに別の複数のミトコンドリア関連遺伝子をRNA干渉法によりノックダウンしたヒト線維芽細胞用いた実験を行ってきた。ミトコンドリアの分裂や融合、エネルギー産生能やストレス制御に関わるDNM1L、MFN2、p32等の遺伝子の機能が欠損・抑制された細胞では、ミトコンドリアの伸展、分裂、融合等の形態変化やエネルギー産生能の低下を生じる。こうした細胞ではミトコンドリア機能に関わる非コードRNAの発現量にも大きな変化が生じていると考えられる。このような非コードRNAを同定するため、ヒト培養細胞を用いてDNM1L, MFN2, p32遺伝子をRNA干渉法によりノックダウン、またCRISPRシステムによりノックアウトした細胞からミトコンドリアおよびミトコンドリア内膜内成分（マイトプラスト）を分画して全RNAを抽出した。ミトコンドリア関連遺伝子を抑制させたことの効果として、ミトコンドリアの形態が変化していることを確認した。得られたミトコンドリアRNAについて発現アレイを用いてmRNA、長鎖非コードRNA、マイクロRNAの発現量を定量した結果、ミトコンドリア関連遺伝子の機能を抑制させた場合に、その影響を受けて発現量が変化したミトコンドリアmRNA、長鎖非コードRNA、マイクロRNAを検出することが出来た。ミトコンドリアの分裂や融合に関わる遺伝子を抑制することにより、共通して発現が変動する長鎖非コードRNAやマイクロRNAも複数検出することが出来た。この中に、ミトコンドリア機能を制御したり影響を及ぼし、ひいてはミトコンドリア病の発症要因にもなるRNAが含まれていると考えられるため、引き続き検証実験を実施している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

学内にて所属部署が異動となり、研究体制及び実験機器利用環境の整備を行った。また新型コロナウイルス感染防止対策に関連した学内各種業務にエフォートを注いだため、研究の遂行が遅れることとなった。

Strategy for Future Research Activity

令和３年度は、令和２年度に遂行する予定だった発現解析実験を行うとともに、実際のエクソソーム含有非コードRNAについて発現解析を行い、エクソソームに含まれるミトコンドリア関連非コードRNAを探索することに注力したい。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス感染対策に関連した業務が大きなエフォートを占めたため、結果として令和２年度に予定していた多くの実験の遂行が困難であった。令和３年度は、令和２年度に遂行する予定だった発現解析実験を行うとともに、実際のエクソソーム含有非コードRNAについて発現解析を行い、エクソソームに含まれるミトコンドリア関連非コードRNAを探索することに注力したい。