Search for the regulatory mechanism of mitochondria by microRNA and long noncoding RNAs

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08266
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 水野 洋介 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (30406532)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ミトコンドリア / エクソソーム / 非コードRNA

Outline of Annual Research Achievements

複数のミトコンドリア関連遺伝子をRNA干渉法によりノックダウンしたヒト線維芽細胞と、別の特定のミトコンドリア関連遺伝子をCRISPR/CASでノックアウトしたヒト線維芽細胞を用いて実験を行って得られたデータを用いた解析を行ってきた。ミトコンドリアの分裂や融合、エネルギー産生能やストレス制御に関わる遺伝子の機能を欠損・抑制した細胞ではミトコンドリア機能に関わる非コードRNAの発現量にも大きな変化が生じていると考えられる。このような非コードRNAを同定するため、ヒト培養細胞を用いてDNM1L, MFN2,p32遺伝子をRNA干渉法によりノックダウン、またCRISPRシステムによりノックアウトした細胞からミトコンドリアおよびミトコンドリア内膜内成分（マイトプラスト）を分画して全RNAを抽出した。得られたミトコンドリアRNAについて発現アレイを用いてmRNA、長鎖非コードRNA、マイクロRNA（miRNA）の発現量を定量した結果、ミトコンドリア関連遺伝子の機能を抑制させた場合に、その影響を受けて発現量が変化したミトコンドリアmRNA、長鎖非コードRNA、miRNAを検出することが出来た。また、ミトコンドリアの分裂や融合に関わる遺伝子を抑制することにより、共通して発現が変動する長鎖非コードRNAやmiRNAも複数検出することが出来た。この中に、ミトコンドリア機能を制御したり影響を及ぼし、ひいてはミトコンドリア病の発症要因にもなるRNAが含まれていると考えられる。実際にミトコンドリア関連遺伝子を標的対象の候補とするマイクロRNAも含まれていた。現在は引き続き非コードRNAのミトコンドリア関連遺伝子との相互作用をしうる塩基配列・二次構造モチーフを検索するなどの、ミトコンドリア機能との関連性を調べるための検証実験を実施している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

一昨年度に配属された学内の所属部署にて研究体制及び実験機器利用環境の整備を行った。また新型コロナウイルス感染防止対策に関連した学内各種業務および対応する学生教育にエフォートを注いだため、研究の遂行が遅れることとなった。

Strategy for Future Research Activity

令和４年度は、これまでに遂行する予定だった発現解析実験を行うとともに、実際のエクソソームに含まれている非コードRNAについて発現解析を行い、エクソソームに含まれるミトコンドリア関連非コードRNAを探索すること、およびそのミトコンドリア機能への関連性の探索に注力したい。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス感染対策に関連した、部署の体制整備業務および学生教育が大きなエフォートを占めたため、令和３年度に予定していた多くの実験の遂行が困難であった。令和４年度は、これまでに遂行する予定だった発現解析実験を行うとともに、実際のエクソソームに含まれる非コードRNAについて発現解析を行い、エクソソームに含まれるミトコンドリア関連非コードRNAを探索することとその機能解析に注力したいと考えている。