Research for analysis of receptor gene used by hepatitis B virus

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08346
• Research Institution: National Center for Global Health and Medicine
• Principal Investigator: 杉山 真也 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 副プロジェクト長 (20612427)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: B型肝炎ウイルス / 受容体 / 生活環 / 感染モデル / 動物モデル

Outline of Annual Research Achievements

RECKとNTCPの相互作用と結合状態を評価した。HBVとNTCPが結合するとNTCPの分子形態が変化するという知見があるため、HBVの有無も条件に加える。細胞固定後に、RECKとNTCPのそれぞれに対して、免疫沈降とイムノブロットを行い、直接的な結合を確認した。
RECKとNTCPの位置関係を可視化するために、RECKとNTCPをそれぞれ蛍光化し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。ヒト由来のNTCPとRECKをマウス細胞株（AML12、FL83B）で強制発現させ（マウス肝細胞のヒト化）、HBV感染が成立するか確認した。加えて、ヒトEGFRの発現もここに加えた。PreS-TAMRAもしくはHBV粒子を投与して、細胞への吸着、細胞内への取り込み、細胞核内移行、ウイルス複製の有無を評価した。ウイルス複製は、感染後約5日間培養を行い、培養上清中のHBs抗原量の経時的な変化をELISAで確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画した研究を予定通りに進めることができた。

Strategy for Future Research Activity

マウス肝細胞株への各種ヒト遺伝子の導入でHBV感染が認められた場合、系統差を考慮して、BALB/cとC57BL/6Jの二系統へ感染に必要な遺伝子の導入をCRISPR等で使って行う。得られたマウスに対して、尾静脈経由でのHBV粒子の投与を行い、感染成立の有無を評価する。肝臓の病理観察（HE染色等）、HBs抗原染色、HBVDNA定量を行う。マウス肝細胞での感染が不成立の場合の対処としては、受容体結合、細胞内取り込み、核内移行のどこで障害が生じているか判明するため、その部分に注目して、ヒト肝細胞で働く遺伝子をデータベースから複数選び、ある程度まとめてマウス肝細胞へ導入することで感染性の変化を検討し、必要な遺伝子を決定する。