2020 Fiscal Year Research-status Report

p68の肝癌細胞及び肝癌血管内皮細胞における機能解析

Research Project

Project/Area Number	20K08392
Research Institution	Nagoya City University
Principal Investigator	野尻俊輔名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (50381843)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	三浦裕至学館大学, 健康科学部, 教授 (90285198)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	肝発癌 / ｐ68
Outline of Annual Research Achievements	細胞培養実験と動物実験を並行して進めている。細胞培養実験：まず3種類のヒト培養細胞の培養を始めた。ヒト内皮細胞培養はヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)を正常内皮細胞として使用し、ヒト星細胞(LX-2)、ヒト平滑筋細胞(PCS-100)も星細胞はMEM溶液にて、平滑筋細胞は専用培地にて培養した。培養状態は比較的良好で継代に成功している。次にヒト内皮細胞におけるp68 の強制発現及びノックダウンを試みた。HUVEC細胞を使用しp68強制発現とsiRNAによる遺伝子ノックダウンを施行した。両者ともヒト肝細胞で使用したものを同じプロトコールで使用した。強制発現、ノックダウンともに肝細胞使用時に比べ効率が悪く実験を十分に施行するには至っていない。現在十分となる効果が得られる条件を検索中である。強制発現系では細胞間による発現効果の差が激しく安定した効果が得られにくい。よってsiRNAでのノックダウンが十分であれば正常細胞とノックダウンでの差で実験を進めることとする。効果が十分であることを確認したのちに網羅的遺伝子解析を施行したい。コンディショナルノックアウトマウス（cKOマウス）の作製はfloxp/p68のホモF1マウスとAlb-CreホモF1マウスを交配させcKOマウスを選別することに成功した。実際に出来上がったKOマウスを使用し肝臓でのp68KOを確認したのちホモでの継代を継続することに成功している。念のためコントロールとしてｐ68とCre-Albマウスも継代を継続する。DENとCCl4の腹腔内投与による肝発癌を誘発するため現在投与観察中である。またDEN単独投与での発癌も文献では多数報告されているため今後はそちらでの検討も行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 細胞培養でのｐ68強制発現が実験間細胞により結果にばらつきがある。現在安定するように検討中である。遺伝子ノックダウンについては比較的安定した結果が得られているので今後安定したら網羅的解析へ進みたい。動物実験は肝臓のｐ68コンディショナルＫＯマウスが出来上がったため現在発癌実験に移行している所である。発癌には時間がかかるためしばらく結果が出るまで待機中です。
Strategy for Future Research Activity	細胞培養は至適条件を見つけ結果を安定させて遺伝子発現変化の網羅的解析を施行予定です。さらに平滑筋細胞、星細胞との共培養の実験も今年度中に始める予定です。動物実験は順調に進んでいますが発癌に時間がかかるためしばらくはこのままの状態で動物実験を継続させていく予定です。
Causes of Carryover	使用細胞は医局内、並びに他科で使用している研究者より譲渡され使用をした。しかし今後実験が安定しない場合再度購入を検討する。ノックアウトマウスにかかった諸経費は使用期限のある財源を充てた事と医局内での共同資金で補填した。来年度からは予定通り当科研費より支出予定です。細胞実験が遅れているため遺伝子の網羅的解析が未施行であり来年度施行予定でありそのため次年度使用額が生じた。