2020 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of the regulation mechanism of CHK1 by Mule during myocardial stress response
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20K08410
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
竹田 健史 金沢医科大学, 医学部, 助教 (90340009)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Mule / 細胞内タンパク質品質管理 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当初、MuleがChk1変異体をユビキチン化し迅速に分解する機構をin vitro下で再現するために、HEK293細胞系やバクテリア発現系を使ってMule組換えタンパク質の大量精製を試みたが、全長460kDaという巨大な酵素であるがゆえに精製産物の量的、質的な問題により上手くいかなかった。
そこでin vivoでの相互作用解析に焦点をあてることに変更し、Muleの全長4374アミノ酸からC末端側を欠損させた様々な長さのMule deletion mutantを作製し、Chk1との結合能を免疫沈降実験によって詳細に調べた。その結果、MuleがChk1との結合に必要な領域を200アミノ酸残基まで絞り込むことができ、これをChk1 binding region (CBR)と名付けた。
興味深いことに、このCBRを細胞内で一過性に過剰発現させるとシクロヘキシミド投与によるChk1変異体タンパクの迅速な細胞内ターンオーバーを遅らせた。さらに、CBRの共発現により内在性Chk1タンパク分解を遅らせ、結果として基底レベルが上昇した。
これらの結果は、内在性Muleに対するCBR過剰発現によるドミナントネガティブ効果であると考えられ、MuleがCBR領域を介してChk1やその変異体と結合し、それらの分解機構に働いていることを示唆した（オンライン発表：第43回日本分子生物学会年会）。
最後に、このCBRと相互作用する心筋細胞内の未知なる標的タンパクを同定するために、ラット心筋由来細胞株H9c2細胞へCBR発現ベクターを導入し、CBRを安定発現するH9c2細胞株を現時点で9クローン樹立することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究開始当初、HEK293細胞系を使ってMule組換えタンパク質の発現精製を試みたが、全長460kDaもの巨大な酵素であるがゆえに大量に活性を保持したまま精製することは今年度中にはできなかった。また、これと同時にMuleのHECTドメインの組換えタンパク質をバクテリア（BL21株）発現系を使って精製を試みた。その結果、可溶性分画でHECTタンパク質を発現させて精製することはできたが、過去の報告とは異なり、我々がバテリア発現系から精製したHECTタンパク質は、in vitro下において組換えChk1タンパク質を有意にユビキチン化する活性能を確認できなかった。
そこで、MuleによるChk1変異体の高度なユビキチン化をin vitro下で再現するという初年度の計画から変更し、生細胞内での詳細なMuleとChk1変異体との相互作用を解析することにした。
MuleのC末端側を欠損させた様々な長さの変異体を作製し、Chk1との結合能を免疫沈降実験によって詳細に調べた結果、MuleがChk1との結合に必要な最小領域を同定し、我々はこれをCBRと名付けた。
次に、このCBRと相互作用する心筋細胞内の未知なる標的タンパクを同定するために、ラット心筋由来細胞株H9c2細胞へCBR発現プラスミドベクターを導入し、CBRを安定発現するH9c2細胞の樹立を試みた。ベクターに由来する薬剤（G418）耐性能を指標にして11クローンを単離し、Western blot解析により、そのうち９クローンで組換えCBRタンパク質を安定発現していることを確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずは、樹立したCBR安定発現心筋細胞を用いて、Chk1以外にもCBRと相互作用する心筋細胞内タンパク質を同定するために、CBRにあらかじめ付加してあるV5タグとHisタグを利用して、これらの特異的抗体を用いたダブルタグ法による免疫沈降実験を行う予定である。これによりMuleが内部のCBRを介してユビキチン化する未知なる心筋ターゲットを同定できると思われる。具体的には、CBR安定発現H9c2細胞をプロテアソーム阻害剤で処理し、その細胞ライセーを最初にHisタグ抗体で免疫沈降後、Hisペプチドで溶出し、続いてこれをV5タグ抗体で免疫沈降し、V5ペプチドで溶出する。このように連続して２つの異なる抗体ビーズを使って免疫沈降することで、より特異的にCBRと相互作用する心筋未知タンパクを精製する。同様の免疫沈降による精製を通常のH9c2細胞でも行い、これをネガティブコントロールとする。両者の質量分析により網羅的に同定した因子の中でCBR安定発現細胞のみで検出された心筋由来タンパク質をリストアップする。
その後、実際にそれらの因子がCBRを介してMuleと結合するのかをin vivoで確認する。またMule siRNAによるそれらCBR結合因子の発現に及ぼす影響も解析する。最後に、心筋細胞への酸化ストレス刺激における、それらCBR結合因子の発現変化や、siRNAによる遺伝子ノックダウンによる心筋細胞の影響を解析する。
上記の一連の実験により、CBRを介したMule複合体による心筋細胞内のタンパク質品質管理機構に関わる新規の因子が明らかになると思われる。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍の影響で購入予定のタンパク解析用試薬の納期が不明でキャンセルを余儀なくされたため。次年度は多少割高であっても当初購入予定の試薬と同等品で納期の早い試薬を優先的に購入し、計画を効率的に進める予定である。
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