2021 Fiscal Year Research-status Report
心筋症を誘発するHOIL-1L遺伝子異常の心筋症発症・進行機序の解明
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20K08421
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
馬場 志郎 京都大学, 医学研究科, 助教 (60432382)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | HOIL-1L異常症 / 心筋症 / iPS細胞 / 細胞周期 / 線維化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
HOIL-1L遺伝子異常症患者の骨格筋細胞・心筋細胞内に異常多糖類が蓄積しており、筋症・心筋症発症原因の一つである可能性についての報告がある。しかしながら、筋芽細胞C2C12とHOIL-1L遺伝子ノックアウトC2C12株（C2C12-KO）、HOIL-1L遺伝子異常症患者から作製したiPS細胞(HOIL-Pt-iPS)、HOIL-1L遺伝子をノックアウトしたiPS細胞(HOIL-KO- iPS)、コントロールiPS細胞(Con-iPS)を用いた実験結果では、これら細胞から分化した骨格筋細胞や心筋細胞内に異常多糖類の蓄積がin vitroで再現されなかった。C2C12とC2C12-KOを用いた実験では、C2C12-KO細胞から分化した骨格筋細胞は形態的にも未熟であり、RNAシークエンシング結果では、細胞の筋分化や筋収縮に関する遺伝子がC2C12-KO由来骨格筋細胞で有意に低下していた。以上の結果から、HOIL-1L遺伝子異常によって骨格筋細胞の発生異常が起こり、骨格筋の脆弱性から筋症が起こることが示唆された。次にCon-iPS、HOIL-Pt-iPS、HOIL-KO-iPSを用いて心筋細胞分化についても評価した、結果、HOIL-Pt-iPS、HOIL-KO-iPSから分化した心筋細胞は異常形態を有し、正常心筋分化が起こりにくかった。これはM期遅延を主とした細胞周期の異常により起こることが示唆された。またHOIL-Pt-iPS、HOIL-KO-iPSから分化した心筋細胞において線維化も有意に誘導されていることが判明した。それら結果から、HOIL-1L遺伝子異常によって細胞周期を主とした原因の心筋細胞の発生異常が起こり、脆弱な心筋細胞が有意に含まれる心臓が発生する。その結果、HOIL-1L遺伝子異常患者の心筋細胞は線維化を起こしやすく心筋症に至る可能性が高いと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以下、今までの結果を列記する。C2C12-KO由来骨格筋細胞は、骨格筋細胞形態、成熟骨格筋マーカーMHCの発現やFusion Indexの結果からC2C12由来骨格筋細胞に比べて未熟である。その分化段階において骨格筋の成熟に関わるMRF4の発現が低下していた。RNAシークエンシングでは、C2C12-KO由来骨格筋細胞において筋細胞分化や筋収縮にかかわる遺伝子が抑制され、線維化に関わる遺伝子が亢進していた。HOIL-Pt-iPS・HOIL-KO-iPS由来心筋細胞は、Con-iPS由来心筋細胞に比べて多核傾向で大きく細胞形態の異常を認めた。これはHOIL-1L遺伝子がM期遅延を伴った細胞周期異常を起こし、細胞分化異常を誘導している可能性が示唆された。Ki-67の発現からもHOIL-Pt-iPS・HOIL-KO- iPS由来心筋細胞の細胞分裂効率は低下しており、HOIL-Pt-iPS・HOIL-KO-iPSの心筋細胞分化において遅延が起こっていることが判明した。HOIL-1L遺伝子ノックアウト（KO）マウスを評価したところ、胎生10.5日において正常マウス胎仔に比較してHOIL-1L遺伝子ヘテロKOマウス胎仔では心臓発生が遅延し、HOIL-1L遺伝子ホモKOマウス胎仔では心臓発生がほとんど認めなかった。しかし実際はHOIL-1L遺伝子異常患者は出生して暫くは心筋症症状を呈さない。よって心筋細胞線維化を線維化マーカーSerpine2の発現を用いて評価した。HOIL-Pt-iPS・HOIL-KO-iPS由来心筋細胞はCon-iPS由来心筋細胞に比べて有意にSerpine2の発現が亢進していた。よって、HOIL-1L遺伝子異常によって心筋細胞発生が障害され未熟心筋を多く含んだ心臓の状態で出生するため、出生後は心筋障害から線維化が起きやすく心筋症に発展する病態が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今までの結果から、HOIL-1L遺伝子異常によって骨格筋・心筋細胞の分化異常を起こすこと、線維化を起こしやすい脆弱性を有した心筋細胞に分化することが示された。今後の研究として、HOIL-1L欠損症患者が筋症や心筋症を発症するためには、HOIL-1L遺伝子異常を有する骨格筋や心筋細胞が機能的に脆弱であるかどうか評価する必要がある。よって本研究の次のステップとして骨格筋や心筋の機能評価を行う予定とする。骨格筋細胞、心筋細胞の機能として活動電位の評価が必要であるが、本研究室に常設しているMulti-electrode array system（MEAシステム）を用いてこれら細胞の細胞外電位を測定し骨格筋細胞や心筋細胞の機能評価することを検討している。MEAシステムでは細胞拍動数、活動電位の強さ、活動電位時間（field potential duration（FPD））を無刺激の細胞において測定し、C2C12・C2C12-KO由来骨格筋細胞、HOIL-Pt-iPS・HOIL-KO- iPS・Con-iPS由来心筋細胞において差があるか評価する。その後に、イソプロテレノールやアドレナリン、またはMEAシステムの刺激電極によって負荷をかけ、同様にC2C12・C2C12-KO由来骨格筋細胞、HOIL-Pt-iPS・HOIL-KO- iPS・Con-iPS由来心筋細胞において細胞拍動数、活動電位の強さ、FPDに差があるか評価する。この時 同時にSerpine2の発現や細胞周期についても評価し、細胞脆弱性が細胞電位のレベルからだけでなく、線維化や細胞周期に対しても影響するか評価検討する予定である。この結果から、HOIL-1L遺伝子異常による骨格筋細胞や心筋細胞の分化異常、機能異常の両側面から筋症、心筋症発症の機序解明が可能と考える。
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| Causes of Carryover |
本研究は概ね順調に進展しており、補助金の使用も問題なく遂行できている。本研究の主となる結果である骨格筋細胞や心筋細胞分化や各々の機能的の評価において、論理的な評価方法を検討するのに他研究者との協議が必要であった。そのため、これら細胞の機能評価実験の開始が予定より遅れたために次年度使用金額が生じた。
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Research Products
(1 results)
