高血圧性心疾患発症における1次線毛構成タンパク質NPHP4の機能解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08464
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 高橋 大 山形大学, 医学部, 講師 (90400548)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: primary cilia / NPHP4 / cardiac hypertrophy

Outline of Annual Research Achievements

高血圧性心疾患は、左室の圧負荷により左室リモデリングを来し、心不全発症の原因となる。1次線毛は、細胞膜上に生じる小さな不動性の突起物であり、機械的刺激に対するセンサーとして働く。1次線毛は、線毛上に局在するレセプターや構造タンパク質により、Wntシグナルを始めとしたさまざまな細胞内シグナルを調節する。Nephrocystin-4 (NPHP4)は1次線毛の構成タンパク質であり、胎生期には、心臓の左右軸の決定や非対称性の獲得に重要な役割を担う。NPHP4が、１次線毛伸長障害を介して高血圧性心疾患を増悪するか検討するために、新生仔ラット心筋細胞やH9C2に対して心肥大刺激・酸化ストレスおよび炎症を惹起して検証を行った。NPHP4は、Wnt3a, angiotensin II, ET-1, H2O2, TNFα刺激に対して、細胞質内でタンパク質発現が増加した。また、IGF-1で刺激した場合も刺激後1時間で細胞質内で増加した。mRNAレベルでの変化はなかったが、膜タンパクを抽出したところ、膜蛋白の中では減少しており、細胞に刺激が加わると、細胞膜からtranslocarionすることが判明した。また、IGF-1刺激はAKTをリン酸化するが、NPHP4のknockdownするとAKTのリン酸化が抑制された。Wnt刺激に対する反応は検証中である。同様に、心筋線維芽細胞でも実験をおこなったが、NPHP4をknockdownするとAKTのリン酸化が抑制されてた。他方、細胞刺激によるNPHP4のtranslocationは乏しく、心筋細胞を中心に今後検証していく方針とした。
現在は、NPHP4の遺伝子多型が心腎症候群や心血管イベントと関連することをまとめ、論文を投稿中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

一般住民健診受診者において、NPHP4の遺伝子多型が心血管イベントの先天的危険因子であることを同定し、論文を投稿している。
NPHP4はこれまで、心組織での発現の検証はほとんどされていなかったが、心筋細胞および心筋線維芽細胞いずれにも発現していることを確認した。これらの細胞に対して心肥大刺激・酸化ストレス刺激・炎症刺激を加えたところ、心筋細胞でより鋭敏にＮＰＨＰ４がtranslocationすることを発見した。NPHP4はユビキチン転移酵素Jade-1を介して、βカテニンのプロテアソーム分解を促進することでWntシグナルを抑制すると報告された。新生仔ラット心筋細胞にWnt3a刺激を加えたところ、NPHP4は一過性に発現が亢進した。次に、NPHP4をknockdownしたところ、心筋細胞ではJade1の発現やWnt/βカテニン経路は変化しなかった。また、Wnt3a刺激を加えても同様にNPHP4をknockdownしても大きな変化は認めなかった。病的心肥大への関連に関しては、Ｊａｄｅ－１を介して経路以外を探索する必要性が示唆された。
一方、ＮＰＨＰ４のをknockdownすることで、AKTのリン酸化が劇的に抑制された。IGF１刺激はAKTのリン酸化を介して、生理的心肥大に関与するが、ＮＰＨＰ４knockdownした心筋細胞では、IGF1で刺激を行ってもAKTのリン酸化が抑制された。このことから、生理的心肥大への関与が示唆された。In vivoでの検討では、大動脈縮窄手術後のNPHP4の発現の変化を検証した。mRNAでは低下することを確認していた。免疫染色を行うと、大動脈縮窄手術後にはNPHP4が核内に局在している細胞が多い所見をえた。in vitroのデータを踏まえて、心筋細胞に刺激が加わると細胞膜から核へ移行する可能性が示唆された。

Strategy for Future Research Activity

NPHP4の遺伝子多型が、心腎症候群や心血管イベントと関連することをヒトサンプルデータで確認した。培養心筋細胞において、NPHP4は種々の刺激に対して反応し、特にAKTのリン酸化を調節するデータを得た。IGF1刺激に対しては、NPHP4をknockdownすると、AKTリン酸化を抑制することから、生理的な心肥大の状態ではNPHP4が機能異常を来すと、適切な心肥大が起きなくなる可能性が示唆された。同様に、AKTは病的心肥大にも関与する。細胞実験において、病的心肥大への影響を検討していく。既報を参照にNPHP4がJade1を介してWnt/βカテニンシグナルを抑制すると考えていたが、心筋細胞では同シグナル経路に変化は乏しく、ほかの経路を検討していく。まずは、新生仔ラット心筋細胞においてＮＰＨＰ４をknockdownしてWnt3aで刺激した場合に、心筋細胞肥大を来すか検証する。
以上の結果を踏まえて、NPHP４遺伝子改変マウスの作成する予定である。NPHP4の全身ノックアウトマウスは心奇形を来す。そのため、Cre/LoxPシステムを用いて、タモキシフェン誘導下にNPHP4をノックアウト可能なマウスを作成することを検討している。生理的心肥大への関与が大きい場合には、エクササイズによる心肥大の検討を行う。病的心肥大への影響が大きい場合には、予定通り、大動脈縮窄手術を同マウスに対して施行する。
NPHP4の機能は、ほとんどわかっていない。構造内にC２ドメイン結合配列があることから、NPHP4はC2ドメインを有した蛋白質を細胞膜から核内に移行する可能性がある。C2ドメインを有した蛋白質は複数あるが、プロテインキナーゼCを中心に検証を行っていく予定である。当講座は過去にプロテインキナーゼCのtranslocationの検証を行った経験がある。

Causes of Carryover

残金は、少額なので、次年度の消耗品購入に使用する予定です。