2020 Fiscal Year Research-status Report
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20K08530
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| Research Institution | University of Occupational and Environmental Health, Japan |
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Principal Investigator |
遠藤 元誉 産業医科大学, 医学部, 教授 (40398243)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | eR1 / 肺癌 / 癌幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
eR1はRunx1の発現を活性化するエンハンサーであり、一部臓器の組織幹細胞ではeR1が活性化していることが明らかになっている。本研究では、肺におけるeR1活性化細胞が肺組織幹細胞の一部をマークしている可能性を明らかにするために、遺伝子改変マウス、培養細胞などを用いて解析を行うことを目的としている。本年度は、ヒト培養細胞株を用いてeR1活性化細胞の機能解析を行った。eR1の活性化を測定するためにGFP上流にヒトHSP70プロモータを組み込んだeR1コンストラクトを作成し、ヒト肺癌細胞株H460細胞、A549細胞に導入しeR1の活性化を測定した。しかしながら、上記コンストラクトでは常にGFPの発現が増強しており、eR1の活性化を適切に観察することができなかった。そのため、プロモーター部位をマウスHSP70あるいはminimal プロモーターに組み換えたコンストラクトを作成し再実験を行った。その結果、minimal プロモーターによるコンストラクトにおいて、eR1活性を適切に測定できることが明らかになったため、今後の実験ではそのコンストラクトを用いて解析を行うこととした。さらに、本実験を施行するのに最適なヒト肺癌細胞の探索も行った。A549細胞、H460細胞では、eR1活性化細胞の割合が血球系細胞と比較して低かったため、より幼若なヒト肺癌細胞を探索した結果、H446細胞ではeR1活性化細胞の割合が比較的高いことを見出した。また、本解析を行う過程でヒト膵癌細胞株PANC-1を用いてeR1活性化を測定できるシステムを構築し、以前見出していた細胞分化を促進させる低分子化合物Xを添加した結果、eR1陽性かつ癌幹細胞マーカー（CD24+CD44+）陽性細胞が減少することを見出した。次年度は、H446細胞においても低分子化合物Xの機能解析を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度実施予定であった実験は、①eR1トランスジェニックマウスを用いたeR1活性化細胞の細胞系譜解析、②マウス由来eR1活性化肺細胞の機能解析、③ヒト培養細胞株を用いたeR1活性化細胞の機能解明であった。COVID-19感染拡大のため、学内における実験室、動物センターへの入室が著しく制限されていたため、マウスを用いたin vivo実験、生体マウス由来の細胞を用いた実験解析の延期を余儀なくされた。そのため、実験①、実験②に関してはスケジュールが遅れたが、緊急事態宣言解除後に一部の実験を進めることができた。しかしながら、マウス繁殖の遅れも生じているため、実験①、②に関しては、今後の実験を効率よく進めていく必要がある。実験③に関しては、順調にスケジュールを遂行することができた。実験③では既に準備していた解析用ツールの検証を行い、より良い解析ができるよう改良した解析用ツールを作成する出来た点で、当初の計画以上に研究が進んでいると考えている。さらに、予定数より多くの細胞種を用いて実験ができたこと、細胞分化を促進させる薬剤（低分子化合物X）関連の実験も遂行できたことより、実験③の進捗は極めて順調である。次年度以降は低分子化合物Xを用いた実験の解析をさらに発展させたいと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度実施予定の実験は、①eR1トランスジェニックマウスを用いたeR1活性化細胞の細胞系譜解析、②マウス由来eR1活性化肺細胞の機能解析、③ヒト培養細胞株を用いたeR1活性化細胞の機能解明、④eR1の活性を制御する低分子化合物Xの機能解析である。実験①に関しては、細胞系譜を解析するための準備を既に行っており、次年度も引き続き解析を行っていく。実験②に関しては、マウスより細胞を抽出してRNA-seq解析を行う予定である。実験③に関しては、引き続き解析を行う。改良された解析ツールを本年度開発することができたため、次年度はそれを用いて細胞のシグナル解析を行う。実験④に関しては、eR1の活性を制御する可能性を有している低分子化合物Xに関して実験を進めて行く。本年度の研究により、低分子化合物Xは細胞分化を促進させ、癌幹細胞を減少させる可能性を有している。肺癌細胞におけるeR1の活性化を指標に、低分子化合物Xが肺癌幹細胞を減少させるか検討する。低分子化合物Xの効果が十分にみられなかった場合には、新たな化合物探索を行うためのツール作成を行う予定である。次年度においても、COVID-19の感染拡大のため、予期せぬ事態が生じる可能性も考えられる。実験を効率よく進めるため、より良い実験方法を探索しつつ実践する予定である。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症拡大のため、ある一定期間、研究室への出入り、業者を介した試薬などの購入が制限されたために、予定していた実験（生体マウスを用いた実験）の延期を余儀なくされた。特に、本年度行う予定であったマウスを用いた実験（薬剤刺激、免疫染色、フローサイトメトリーなど）、生体マウス由来の細胞を用いて行う解析（フローサイトメトリー、RT-PCR、高速シーケンス解析など）の計画が大幅に遅れてしまい、それらの実験に使用する予定であった試薬購入が出来なかった。現在、マウスを用いた上記実験がスムーズに行うことができるように準備を進めている。次年度では予定していた研究に加え、上記研究も含めた解析を行っていく予定である。
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