Development of novel therapies for idiopathic pulmonary pneumonia with a human primary lung epithelial cell model

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08566
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 今井 晶 (松島晶) 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (40828943)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): オケヨ ケネディオモンディ 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 講師 (10634652) ; 今井 誠一郎 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (90572610) ; 伊藤 功朗 京都大学, 医学研究科, 准教授 (40447975)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 肺初代上皮細胞 / 細胞シート

Outline of Annual Research Achievements

2021年11月にヒト初代細胞の単離培養を行う環境が整い、漸く研究に着手することができた。
京都大学医学部附属病院呼吸器外科において施行された手術標本の肺組織（凍結保存組織を含む）から初代上皮細胞を単離し、マイトマイシンC処理をしたNIH3T3細胞をフィーダーとして共培養を行った。上皮細胞コロニーの良好な発育を確認し、また、週1回の継代による長期培養実験において3か月を経過後も良好な増殖効率が保たれること、また任意の時点で凍結保存が可能であることも確認した。
患者由来のヒト肺初代上皮細胞について再現性の高い安定的な供給が可能となったため、これを用いた気液界面培養（ALI)モデルの作成に着手した。分担研究者作成のマイクロメッシュに細胞外マトリクスの薄膜を張った培養基材について、強度と細胞接着性の検討を行った。デシケーション処理のみの薄膜では十分な強度が得られなかったためこれをパラホルムアルデヒド固定し、さらに細胞の接着性を得るために低濃度の細胞外マトリクスでコートしたものを用いることで、播種後2週間にわたり上皮シートを維持することに成功した。
作成した上皮シートの特性を評価するため、2022年2月から、固定標本の免疫蛍光染色により構造と分子マーカーの発現確認を開始した。これにより、シートが単層の上皮であること、また、上皮型カドヘリンおよびオクルディンを発現することが確認できた。
記載時点で実際に研究を開始して約6か月であるが、当初の計画において着手後7～8か月分の予定を達成しつつある。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本研究の開始は2020年度であったが、京都大学医学部附属病院におけるCOVID-19対策として診療従事者の研究活動が制限され実験を開始することができなかった。2021年11月にヒト肺初代細胞の単離培養を行う環境が整い、研究に着手した。記載時点で実際に研究活動を遂行できた期間は5か月程度であり全体の計画からは遅れているが、研究に着手後は計画に沿ってほぼ順調に進行している。

Strategy for Future Research Activity

研究開始後はほぼ順調に予定をこなしているが、現在も共焦点顕微鏡などの配置された共通機器室の利用が困難であるなどの制限が存在する。今後も粘り強く研究体制の整備を進めつつ、可能な実験から柔軟に取り組む予定である。

Causes of Carryover

京都大学医学部附属病院におけるCOVID-19対策として研究活動が制限され、本課題の実験に着手したのが2021年11月と遅れたため。