2021 Fiscal Year Research-status Report
腎糸球体上皮細胞スリット膜におけるNeurexinの役割の解明
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20K08587
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
福住 好恭 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (20609242)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
内許 玉楓 新潟大学, 医歯学系, 助教 (00529472)
安田 英紀 新潟大学, 医歯学系, 助教 (00806490)
河内 裕 新潟大学, 医歯学系, 教授 (60242400)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ポドサイト / スリット膜 / neurexin / CD2AP / Par6 / synaptotagmin / SV2B |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Neurexin1αのスリット膜のバリア構造維持における役割を明らかにするため、本年度（令和3年度）は、（1）Neurexin1α KOマウス糸球体におけるシナプス小胞関連分子群の発現解析、（2）Neurexin1α KOマウス糸球体におけるスリット膜関連分子の局在解析、（3）Neurexin1αとスリット膜関連分子の相互作用解析、（4）マウス培養ポドサイトにおけるNeurexin1αノックダウンの影響について解析した。
（1）Neurexin1α KOマウス糸球体におけるシナプス小胞関連分子群の発現をリアルタイムPCRにより解析し、KOマウス糸球体でneuroliginやSNARE複合体分子群の発現は変化せず、シナプス小胞分子SV2Bとsynaptotagminの発現が低下することを示した。
（2）KOマウス糸球体におけるスリット膜関連分子の局在を免疫染色により解析し、KOマウス糸球体でNEPH1とsynaptopodinの局在は変化せず、CD2APとPar-6の局在が変化することを示した。
（3）Neurexin1αとスリット膜関連分子の相互作用を単離糸球体可溶化材料を用いた免疫沈降法により解析し、NEPH1とsynaptopodinはNeurexin1αと相互作用しないが、CD2APとPar-6は相互作用することを明らかにした。
（4）マウス培養ポドサイトにNeurexin1α siRNAを処理し、Neurexin1αの発現低下を誘導した。ノックダウンポドサイトで、CD2AP染色の染色性が低下すること、細胞突起が減少することを示した。
以上より、Neurexin1αはシナプス小胞分子SV2B、synaptotagmin、スリット膜関連分子CD2AP、Par-6の発現、局在に必要であることを示し、Neurexin1αはスリット膜のバリア構造維持に重要であることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Neurexin1αのスリット膜のバリア構造維持における役割を明らかにするため、本年度は以下の4つの検討を行った。
（1）Neurexin1α KOマウス糸球体におけるシナプス小胞関連分子群の発現を検討するため、KOマウス腎皮質材料を用いたリアルタイムPCR解析を行った。その結果、KOマウス糸球体でneurexinの相互作用分子neuroliginやSNARE複合体分子群（synaptobravin、SNAP-25、syntaxin）の発現は変化せず、シナプス小胞分子SV2Bとsynaptotagminの発現が低下することを示した。
（2）KOマウス糸球体におけるスリット膜関連分子の局在を免疫染色により解析した。その結果、KOマウス糸球体で細胞膜分子NEPH1、細胞骨格分子synaptopodinの局在は変化せず、スリット膜機能分子CD2APとPar-6の局在が変化することを示した。
（3）Neurexin1αとスリット膜関連分子、ポドサイト機能分子の相互作用を単離糸球体可溶化材料を用いた免疫沈降法により解析した。その結果、NEPH1とsynaptopodinはNeurexin1αと相互作用しないが、CD2APとPar-6は相互作用することを明らかにした。
（4）マウス培養ポドサイトのノックダウン系（siRNA）によるNeurexin1αの機能解析を行った。その結果、ノックダウンポドサイトでCD2AP染色の染色性が低下すること、細胞突起が減少することを示した。
以上より、KOマウスで変化が観察されたSV2B、synaptotagmin、CD2AP、Par-6はNeurexin1αの関連分子であることが本研究で初めて示唆され、Neurexin1αはスリット膜のバリア構造維持に重要であることを明らかにしたので、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究代表者は昨年度、ポドサイトで特異的に発現しているNeurexin1αのスプライスサイト（SS）4（+）の分子型が、細胞外部ドメインでスリット膜主要分子ネフリンと結合することを示した。令和4年度では、SS4の有無におけるNeurexin1αとCD2APの相互作用の影響を検討する。具体的には、HEK293細胞にNeurexin1α-SS4(+)とCD2AP、Neurexin1α-SS4(-)とCD2APを共発現させた材料を用いて、免疫沈降法を行う。また、HEK293細胞の発現系でNeurexin1αとCD2APの結合が観察された場合、Neurexin1αのCD2AP結合部位を決定するため、Neurexin1α-SS4(+)の細胞内部ドメインの前半と後半部を欠損させた変異体を用いて、CD2APとの免疫沈降を行う。
また、ネフローゼ症候群モデルラットにおけるNeurexin1αとスリット膜機能分子（ネフリン、CD2APなど）の局在、発現解析を行う。研究代表者らは、以前、正常糸球体でNeurexin1とCD2APが共局在すること、ネフローゼ症候群モデルラット糸球体でNeurexin1αの発現が低下することを報告した。しかし、ネフローゼ症候群モデルラット糸球体で残存しているNeurexin1αがCD2APと共局在しているかどうかは不明である。そこで、抗ネフリン抗体誘導腎症、及びpuromycin aminonucleoside腎症、adriamycin腎症のネフローゼ症候群モデルラットを用いてNeurexin1αとCD2APの二重染色を行う。CD2APで変化が観察されなかった場合、ネフリンなどの他のスリット膜機能分子とNeurexin1αとの局在解析を行う。
また、発達期糸球体におけるNeurexin1αの発現解析を行い、Neurexin1αがスリット膜形成に関与しているかどうかを検討する。
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| Causes of Carryover |
研究が順調に進んだため、遺伝子改変マウスの飼育経費が抑えられた。さらなる解析に必要なネフローゼ症候群モデルラットの作製と飼育経費、及び相互作用解析に必要な試薬を購入する。
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