急性腎障害の遷延機序解明を通した慢性腎臓病の重症化抑制法の開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08614
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 岡田 浩一 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (60233342)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井上 勉 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (30406475)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 腎線維化 / 尿細管上皮細胞 / 形質転換 / 細胞周期

Outline of Annual Research Achievements

Fucci2aRマウスとgGT.Creマウスの交配により、尿細管上皮細胞が細胞周期に対応して異なる蛍光を発するgGT.Cre;Fucci2aRTg/+マウス（G1/S期：mCherryによる赤色蛍光（560nmレーザー、610/20nmバンドパスフィルターで検出）、S/G2/M期：mVenusによる緑色蛍光（488nmレーザー、525/50nmバンドパスフィルターで検出））を作出し、片側尿管を結紮する一側尿管閉塞（UUO）モデルを作成する。３、７、１０、１４日目に安楽死させ、組織学的に尿細管上皮細胞の細胞周期の推移を解析し、経時的にG2/M期に相当するmVenus陽性の尿細管上皮細胞が増加することを確認した。また線維化腎組織から酵素消化と機械的分散法を併用して、効果的に尿細管上皮細胞の単細胞浮遊液を作成する方法を検討している。現時点でmVenus陽性細胞の回収率は十分ではないものの、mCherry陽性細胞と比較して、Snail1やCCN2などの線維化形質に関わるマーカー発現が有意に増加していることを明らかとした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

FACSにより各細胞周期にある尿細管上皮細胞を回収しmRNAを抽出、遺伝子発現解析用マイクロアレイ用いて発現遺伝子を網羅的に検討する予定であるが、腎組織の単細胞化させるための至適処置は同時に死細胞数を増加させ、FACSによる回収時にmVenus陽性細胞と死細胞がオーバーラップするため、十分な細胞数の改修に苦慮している。

Strategy for Future Research Activity

FACSによって分離回収した各細胞周期に位置する尿細管上皮細胞の形質評価のためにcDNAマイクロアレイを実施予定であるが、平行してin vivoの形質変化を評価するために、線維化組織のビブラトーム切片上での線維化関連マーカーとの共染色を実施する。そしてmVenus陽性細胞に認められた形質マーカーについて、その発現量をFACSによって得られた検体をddPCR（droplet digital PCR）を用いて別途検討する。

Causes of Carryover

腎組織の単細胞化処置の条件設定に時間を要しており、疾患モデルマウスの作出数が少なくなった。次年度以降、作出数の増加分に充てる。