2020 Fiscal Year Research-status Report
The identification of the antigen and deposition proteins in glomerulonephritis and glomerular deposition diseases
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20K08619
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
清水 章 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (00256942)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石井 永一 日本医科大学, 大学院医学研究科, 研究生 (00193243)
桑原 尚美 日本医科大学, 医学部, テクニカルスタッフ (00599011)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | LC-MS/MS法 / プロテオミクス / 質量分析 / 腎生検病理検体 / レーザーマイクロダイセクション / 腎沈着病 / 免疫複合体病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は 糸球体腎炎の原因抗原の同定と腎沈着症の沈着物の沈着機序の解明をすることを目的に、高感度の液体グロマトグラフィ/タンデム質量分析法(LC-MS/MS法)を用いて、腎臓内に存在する微量蛋白質を解析している。LC-MS/MS法解析の特徴を最大限に活かし、腎生検病理検体を用いて病変局所での微量蛋白質の解析を進めている。腎生検病理検体からレーザーマイクロダイセクションで糸球体や尿細管を単離し、LC-MS/MS法による微量蛋白質の解析を行っている。現在までに、腎アミロイドーシスの腎生検病理検体からレーザーマイクロダイセクションを用いて糸球体を単離し、LC-MS/MS法で存在蛋白質の存在を確認し、糸球体蛋白の同定には凍結検体よりもパラフィン固定検体が適していること、腎生検検体からレーザーマイクロダイセクションを用いて糸球体や尿細管間質を単離する際の単離量やLC-MS/MS法を行うための蛋白分解酵素の濃度と量などの至適サンプル条件を確認した。また、膜性腎症などのImmune complex型糸球体疾患の糸球体内に存在する蛋白質を解析し、すでに知られているPLA2Rなどの既存の原因抗原と免疫染色で同定される蛋白との相関を検討し、この方法により、原因抗原の確認が可能であることを確認した。また個々の腎沈着症と考えられる症例に対して、腎生検検体からレーザーマイクロダイセクションを用いて糸球体を単離し、LC-MS/MS法を用いて沈着蛋白を確認し、確定診断にまで進んだ症例の症例報告を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は 糸球体腎炎の原因抗原の同定と腎沈着症の沈着物の沈着機序の解明をすることを目的に、高感度の液体グロマトグラフィ/タンデム質量分析法(LC-MS/MS法)を用いて、腎臓内に存在する微量蛋白質を解析している。現在までに、腎生検病理検体からレーザーマイクロダイセクションを用いて糸球体を単離し、LC-MS/MS法で存在蛋白質の存在を確認するための、レーザーマイクロダイセクションで単離する際の単離量や、LC-MS/MS法を行うための蛋白分解酵素の濃度と解析蛋白量などの至適サンプル条件を確認し、腎生検病理検体からの解析の至適条件の設定が終わっている。また、膜性腎症などのImmune complex型糸球体疾患の糸球体内に存在する蛋白質をレーザーマイクロダイセクションで腎生検検体内から糸球体を単離し、LC-MS/MS法で解析を行い、すでに膜性腎症の主要抗原として知られているM型ホスホリパーゼA2 受容体（PLA2R）と免疫染色で同定される蛋白との相関を検討し、原因抗原の同定が可能であることを確認している。個々の腎沈着症と考えられる症例に対して、腎生検検体からレーザーマイクロダイセクションを用いて糸球体を単離し、LC-MS/MS法を用いて沈着蛋白を確認し、いくつかの症例で確定診断にまで進めることができた。解析条件の設定を確認し、解析が進められているため概ね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Immune complex型糸球体疾患の抗原を同定し、疾患の病因、発症・進展機序、血中特異抗体価の測定や新たな治療の開発を進める。膜性腎症では、 PLA2R陽性膜性腎症については進めているものの、さらにすでに診断されている一次性および二次性膜性腎症について、腎生検検体からの単離糸球体をLC-MS/MS法で微量蛋白質群を解析し、既知の抗原蛋白を同定するとともに、未知の抗原蛋白の可能性について検討を進める。原因抗原がすでに知られているB型肝炎関連腎炎のHBeAg や溶連菌感染後急性糸球体腎炎の腎炎惹起抗原 (NAPlr)が単離糸球体の LC-MS/MS法で同定可能かを検証する。腫瘍関連膜性腎症を含むparaneoplastic glomerulopathyの症例で腎生検病理検体を用いて抗原を同定する。また、原因抗原が明らかではない immune complex型糸球体疾患(糸球体に免疫グロブリンが陽性になる糸球体腎炎)と考えられる疾患群としてIgA腎症、紫斑病性腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎 (MPGN)、ループス腎炎、感染関連糸球体腎炎症例と対象腎生検検体からの単離糸球体をLC-MS/MS法で微量蛋白質群を解析し抗原の同定を試みる。また、糸球体沈着症や間質尿細管沈着症の特異なorganized structureや crystalなどの構造を有する沈着物の組成の解析を進める。さらに、糸球体沈着症や尿細管間質沈着症の動物モデルでの再現のための、動物モデルの作成を進める。
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| Causes of Carryover |
腎生検検体を用いて、レーザーマイクロダイセクションによる対象組織の抽出とLC-MS/MS法による質量分析を進めている。今年度は予定していた解析症例数に至らず、解析を進めようと考えている腎沈着症や抗原を同定しようとしている免疫複合体病が十分に揃わなかった。糸球体腎着症や腎沈着症、免疫複合体病に対するLC-MS/MSの解析は症例数に依存する。次年度は、積極的に解析が進められるよう、症例の発掘を含め検討を進める。
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Research Products
(4 results)
