2023 Fiscal Year Research-status Report
Molecular Genetics of Human Disorders Associated with Defects in Nuclear Envelopes
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20K08624
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
塚口 裕康 関西医科大学, 医学部, 講師 (60335792)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 疾患遺伝子 / 腎不全 / 核膜孔 / ポドサイト / 腎硬化症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【背景】近年核膜機能や構造異常が、ネフローゼ、心筋症、神経発達障害などのさまざまなヒト疾患の原因となることが注目されている。核膜孔を介する核-細胞質間の輸送や、核膜を支える細胞骨格は、細胞の分化 生存など生命活動に必須の役割を担う。先行研究において、核膜孔複合体を構成するヌクレオポリンNUP107, NUP133のbiallelic 変異により、巣状分節性糸球体硬化症や、中枢神経形成異常が起こることを報告した(Am J Hum Genet 2015, Annual Neurol 2018）。
しかしヌクレオポリン遺伝子の変異による疾患群、いわゆるNucleoporinopathyは、表現型(臓器特異性,重症度)は多様性に富み、複数の分子間の相互作用や、シグナル伝達のクロストークなどのまだ未解決の機序の関与が想定される。
【目的】本研究では「核膜がどのように細胞の分化、器官形成、生命維持に関わるか?」という疑問について、ヒト患者家系のサンプルを用いて遺伝学的解析を行い、病態の解明に取り組む。とくに腎疾患に限定せず、終末分化細胞であるために再生困難で、細胞死に到りやすい、神経細胞、心筋細胞、ポドサイトなどを主座とする疾患群の遺伝子変異を探査し、Nucleoporinopathyに共通する生命現象を、明らかにする。
【方法】核膜異常が関与しうる“3主要疾患群”(糸球体硬化症、心筋症、神経発達障害）における、核膜関連遺伝子について次世代シークエンサを用いて、全ゲノム or エクソン解析を行い、病因変異を網羅的に探索する。病因性がはっきりしないVUSについては、培養細胞を用いたトランスフェクションを行い、細胞の形態的変化を観察、さらに生化学的にもシグナル伝達系の変化を調べる。また遺伝子編集疾患モデルマウスを用いて個体レベルでの病態機序を解析する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請課題の対象となる核膜異常が想定される症例（腎不全、心筋症、神経発達障害、さらにその組み合わせ等)を、本学附属病院臨床遺伝センターにおいてカウンセリングを実施するとともに、病歴情報と検体を収集した。ゲノムDNAは倫理委員会承認のプロトコールに従い、発端者以外にも両親、同胞からも採取した。10症例のトリオサンプルにして全ゲノムシークエンスを行い、現在候補遺伝子の絞り込みを行っている。
疾患遺伝子を特定するためには、臨床表現型の解析も重要であり、組織サンプルにおけるゲノム情報、転写物や蛋白の発現プロフィールを検討している。生検病理標本のパラフィンブロックから核酸(DNA, RNA)抽出して、シークエンスを行った。またパラフィン病理切片の免疫染色、電顕観察などを実施した。研究計画の3年間で、目標の症例はほぼ達成できている、と考えている。また検出されたバリアントの病原性の検証(アレル頻度、変異予測プログラム）、バイオインフォマティクス(パスウェイ解析）は、本学生命医学研究所ゲノム解析部門との共同研究で、効率的に行うことができた。今後も症例を増やす予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
② 再シークエンス解析：すでにエクソーム解析を実施したが診断未確定の症例について、トリオ血液検体(両親、患児)を用いて全ゲノムNGS解析を行う(Macrogen)。また最新のヒトゲノム参照配列(GRCh38.p14)、疾患遺伝子データベース(HGMD)、ClinVar、既報の論文等を参考にして、variantsの再フィルター化を行う。またLong-Read シークエンスを併用し、これまで検出できなかった大きな構造変異、リピート異常、Haplotype Phase 決定も試みる。
③ 疾患マーカーの探索： 生検あるいは剖検組織(脳、腎)を用いてDeep ゲノムシークエンスを行いモザイク変異を探索する。さらにRNAシークエンスで、RNA化学修飾異常、スプライス変異を探査する。ACMG基準でP,LP, VUS判定となるvariant について、細菌, Archaea, 酵母等の比較ゲノム遺伝、表現型情報を基に、細胞質リボゾームでの蛋白合成経路に関わる遺伝子を絞り込む。ミトコンドリア変異の検出もヘテロプラスミーを考慮して、複数の組織で検討する。
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| Causes of Carryover |
初年後がこれまで収集したデータの集計と解析、論文作成が主となり、支出は抑えることができた。次年度からは、シークエンス解析を開始する予定である。
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