2021 Fiscal Year Research-status Report
機能的CRISPRスクリーニングによるポドサイト恒常性関連遺伝子の網羅的解析
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20K08642
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
佐々木 隼人 北里大学, 獣医学部, 講師 (20768048)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ポドサイト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CRISPRスクリーニングを実施する準備を行なった。すなわち、マウス由来ポドサイト細胞株に対するレンチウイルス粒子の感染効率の最適化（感染時の細胞密度、ポリブレン濃度、感染時間、導入培地の血清濃度）の検討、薬剤選抜の最適化（ピューロマイシンおよびブラストサイジンの濃度、選抜時の細胞密度、選抜を開始する時間）の検討、レンチウイルス粒子の機能的感染力価の測定を行なった。続いて、レンチウイルスベクターによりCas9を発現するマウス由来ポドサイト細胞株を作成し、３つのクローン細胞株を得た。これらのクローンに対して、ポジティブコントロールとして特定のgRNAを発現するレンチウイルスベクターを導入し、薬剤選抜を行なった後、DNAシークエンス解析を行ったところ、遺伝子に変異が導入されていることが確認された。つまり、Cas9が機能していることが確認された。また、クローン細胞株に対して改めてレンチウイルス粒子の機能的感染力価の測定を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
CRISPRスクリーニングの実施には至らなかったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
Cas9を発現するマウス由来ポドサイト細胞株にgRNAを発現するレンチウイルスライブラリーを導入する。このポドサイト細胞株ライブラリーを初年度に確立した方法により細胞分離する。分離された細胞のgDNA配列をPCRにより増幅、次世代シークエンサーにより解析し、分離前よりエンリッチされたgRNAの標的遺伝子を同定する。
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