2021 Fiscal Year Research-status Report
皮膚に病変を作る病原性抗酸菌の低体温部親和性増殖の分子メカニズムと病原性の解析
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20K08663
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
中田 登 国立感染症研究所, ハンセン病研究センター 感染制御部, 室長 (70237296)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 温度感受性増殖 / Mycobacterium marinum |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ハンセン病の原因菌であるらい菌は、人工培地での培養が未だなお達成されていないが、温度感受性増殖を示し、25℃-33℃で37℃より良好な代謝活性を示すことが示されており、このことが皮膚などの低体温部親和性増殖の理由であると考えられている。37℃より低い温度で良く増殖する性質は、近縁の数種の抗酸菌に共通しており、これらの菌は共通して皮膚に病変を作る。一方、抗酸菌Mycobacterium smegmatisは37℃でよく増殖する培養可能菌であるが、この菌のDNAジャイレース遺伝子gyrBAをらい菌のもので置換した組換菌は37℃では増殖せず、33℃で良好に増殖する。らい菌と近縁関係にあり、同様に比較的低温で良好に増殖する抗酸菌Mycobacterium marinum、及びMycobacterium haemophilumについて、らい菌と同様にDNAジャイレースが温度感受性を示すかどうかを調べるため、これらの菌のgyrBA遺伝子でM. smegmatisのgyrBAを置換した菌を作製したが温度感受性にならなかった。そこでこれらの菌の温度感受性増殖の原因因子を探るため、35℃以上で増殖しないM. Marinumの臨床分離株を用い、徐々に培養温度を上昇させることにより37℃で増殖する変異株の分離を試みた結果、37℃では増殖しないが35℃で増殖する変異株を2株分離した（MM35A-1株、MM35C-1株）。これらの変異株と親株のゲノムシーケンスを比較するため、まず親株のゲノムシーケンシングを行って全ゲノムDNA配列を決定した。2種の変異株については、ショートリードの次世代シーケンサーで配列を解析し、親株から変化した配列を明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
皮膚に病変を作る病原性抗酸菌の温度感受性増殖の分子機構の解明のために、M. marinum臨床分離株から変異株を分離する試みについては、37℃増殖株の分離には至っていないが、親株が増殖する上限温度より2℃高い温度の35℃で増殖する株の分離には複数株成功している。これらの高温増殖株については、一度33℃に培養温度を下げて増殖させた後に再び温度を上げて培養してもやはり35℃で増殖することから、培養温度を上げたことによる遺伝子発現の誘導といったようなことが原因ではなく、変異によって菌の生存にかかわる因子の性質が変化したことによるものと考えられる。高温増殖株で変異したDNA配列を解析するために、まず、親株のゲノムシーケンシングを行い、ショートリードとロングリードの２種類の次世代シーケンサーによる配列解析で全ゲノムDNA配列を決定した。35℃増殖変異株については、ショートリードの次世代シーケンサーで解析を行い、親株の配列をリファレンスとして比較した。両者の比較から、30から50カ所程度の変異が検出された。検出された変異の多くは、PE-PGRSファミリーに属するタンパクや、機能不明のタンパクをコードする遺伝子上にあったが、遺伝子発現制御に関わるタンパク、細胞分割に関与するタンパクなど、菌の増殖に重要と考えられる因子をコードする遺伝子状にも変異が見られた。これらの変異が検出された部位について、PCR増幅とサンガーシーケンシングにより配列の確認を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
分離した35℃で増殖可能なM. marinum変異株を用い、さらに培養温度を徐々に上昇させることにより37℃で増殖する実験室変異株の分離を引きつづき行う。分離した後は、ゲノムDNA配列を決定して、親株、及び35℃増殖可能株と比較することにより変異した塩基を全て明らかにする。既に分離・解析済みの35℃増殖株を含め、親株と比較して変異した配列が含まれる遺伝子領域を変異株からクローニングし、組換えにより親株に導入することにより、増殖可能温度の上限に変化が見られるかどうかを調べる。この性質には複数の因子が関与している可能性が高く、また変異株を分離する過程で温度感受性増殖とは直接関係しない変異も蓄積してることが考えられるため、通常のプラスミドベクターを使用する遺伝子導入系だけではなく、40kb程度のDNA領域を一度に扱うことが可能で数十の遺伝子を一度に導入可能なシャトルコスミドベクターを利用して、変異株から親株に遺伝子を導入し、増殖可能となる温度の上限の変化を調べ、増殖温度の上限に変化をもたらした原因となるDNA領域を限定していく。M. marinumで温度感受性増殖の原因を作っている因子については、その性質がらい菌、M. haemophilumなどを含め、近縁種の中で種を越えて保存されているかどうかを組換えを行って調べる。35℃や37℃で増殖可能となった実験室変異株と親株を、培養細胞に感染させ、菌の増殖、サイトカイン産生などを調べて温度感受性増殖の病原性に与える影響を調べる。
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| Causes of Carryover |
ゲノムDNAの次世代シーケンサーによる解析にかかった費用が予定より少なかったことなどが理由である。
次年度は追加で分離した変異株の次世代シーケンサー解析や、長鎖DNAの遺伝子組み換えに必要な試薬などに使用する予定である。
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