2022 Fiscal Year Research-status Report
皮膚に病変を作る病原性抗酸菌の低体温部親和性増殖の分子メカニズムと病原性の解析
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20K08663
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
中田 登 国立感染症研究所, ハンセン病研究センター 感染制御部, 室長 (70237296)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 温度感受性 / Mycobacterium |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ハンセン病の原因菌であるらい菌は、人工培地での培養が未だなお達成されていないが、温度感受性増殖を示し、25℃-33℃で37℃より良好な代謝活性を示すことが示されており、このことが皮膚などの低体温部親和性増殖の理由であると考えられている。37℃より低い温度で良く増殖する性質は、近縁の数種の抗酸菌に共通しており、これらの菌は共通して皮膚に病変を作る。そこでこれらの菌の温度感受性増殖の原因因子を探るため、35℃以上で増殖しないM. Marinumの臨床分離株を用い、徐々に培養温度を上昇させることにより37℃で増殖する変異株の分離を試みた結果、37℃では増殖しないが35℃で増殖する変異株を2株分離した（MM35A-1株、MM35C-1株）。親株である臨床分離株のゲノム全塩基配列を決定した結果、6,624,057塩基対からなっており、変異株との差異を解析した結果、検出された塩基置換の多くは、PE-PGRSファミリーに属するタンパクや、機能不明のタンパクをコードする遺伝子上にあったが、遺伝子発現制御に関わるタンパク、細胞分割に関与するタンパクなど、菌の増殖に重要と考えられる因子をコードする遺伝子上にも変異が見られた。一方、らい菌のDNAジャイレースは温度感受性を示し、37℃より、30℃-33℃で高い活性を示す。抗酸菌Mycobacterium smegmatisのDNAジャイレース遺伝子gyrB-gyrAをらい菌のもので置換する実験により、主にらい菌gyrAに温度感受性の性質があることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
皮膚に病変を作る病原性抗酸菌の温度感受性増殖の分子機構の解明のために、M. marinum臨床分離株から変異株を分離する試みについては、親株が増殖する上限温度より2℃高い温度の35℃で増殖する株の分離には複数株成功している。親株については、ゲノムシーケンシングにより、全ゲノムのDNA配列の決定を行った。両者の比較から、30から50カ所程度の変異が検出された。検出された変異の多くは、PE-PGRSファミリーに属するタンパクや、機能不明のタンパクをコードする遺伝子上にあったが、遺伝子発現制御に関わるタンパク、細胞分割に関与するタンパクなど、菌の増殖に重要と考えられる因子をコードする遺伝子状にも変異が見られた。さらに、これらの高温増殖株のひとつから、より高い温度で増殖可能な変異株を分離し、現在解析を行っている。DNAジャイレースについては、M. marinum、M. haemophilumのgyrB-gyrAは、組換え菌においてM. smegmatisに温度感受性の性質を与えなかったことから、らい菌DNAジャイレースのみが温度感受性をもつことが示唆され、最もらい菌のものに近いDNA配列を持つM. haemophilumと、らい菌のDNAジャイレース遺伝子との異種間でgyrB遺伝子とgyrA遺伝子を組み合わせた組換え株を作製し、増殖における温度の影響を調べた結果、らい菌のgyrA遺伝子を持つ株のみが温度感受性増殖を示したことから、温度感受性の原因は主にらい菌のgyrA遺伝子産物の性質にあることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
35℃で増殖可能なM. marinum変異株から分離した、より高い温度で増殖可能な菌株については、ゲノムDNA配列の決定を行って、親株、及び35℃増殖可能株と比較することにより変異した塩基を全て明らかにし、増殖可能温度の上限に影響する因子について解析する。既に分離・解析済みの35℃増殖株と、新たに分離した変異株から、増殖可能温度に影響を与える可能性のある因子をコードする遺伝子領域のクローニングを行い、組換えにより親株に導入することにより、増殖可能温度の上限に変化が見られるかどうかを調べる。一方、塩基配列情報とは別に、40kb程度のDNA領域を一度に扱うことが可能で数十の遺伝子を一度に導入可能なシャトルコスミドベクターを利用して、変異株から親株に遺伝子を導入し、増殖可能となる温度の上限の変化を調べ、増殖温度の上限に変化をもたらした原因となるDNA領域を限定する試みを行う。近年新たにハンセン病の原因菌の一つとして同定されたMycobacteirum lepromatosisは同様に温度感受性増殖を示すことが推測されるが、ゲノム塩基配列情報が利用可能となっているので、これと比較することにより、増殖可能温度に影響を与える因子の推定を行う。温度感受性を示すらい菌のDNAジャイレースについては、この性質を持たない他の抗酸菌のDNAジャイレースのアミノ酸配列と比較し、組換えを行うことにより、この性質の原因となっているアミノ酸配列とタンパク質構造の解析を行う。
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| Causes of Carryover |
ゲノムDNAの次世代シーケンサーによる解析にかかった費用が予定より少なかったことなどが理由である。
次年度は追加で分離した変異株の次世代シーケンサー解析や、長鎖DNAの遺伝子組み換えに必要な試薬などに使用する予定である。
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