2020 Fiscal Year Research-status Report
The analysis of the variable region of the patients with bullous pemphigoid autoantibody
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20K08684
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
皆川 智子 弘前大学, 医学部附属病院, 助教 (20436033)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
澤村 大輔 弘前大学, 医学研究科, 教授 (60196334)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 水疱性類天疱瘡 / Bullous pemphigoid / BP180 ELISA / NC16aアフィニティーカラム / NC16aドメイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
水疱性類天疱瘡(Bullous pemphigoid; BP)は全身の皮膚で表皮下水疱が多発する，最も頻度が高い自己免疫性水疱症であり，高齢者に好発する．BP患者の血清中には皮膚の基底膜を認識する抗基底膜抗体が存在する．その自己抗体が認識する自己抗原として，BP230とBP180の類天疱瘡抗原が同定されたが，その後の研究から，病態形成に関与している自己抗原は，BP180と考えられている．
BPではほとんどの患者が，1497アミノ酸からなるBP180のなかの非常に狭い領域の，76アミノ酸からなるnon-collagenous 16a domain (NC16aドメイン)を認識していることが解明された．実際に抗BP180抗体測定に関しては，細胞膜に近い細胞外に位置するNC16a を大腸菌で発現させた蛋白を使用している．NC16aドメインはわずか76個のアミノ酸で構成され，BP患者血中抗体の主要エピトープであるため，この部位の組み換え蛋白を使用している．通常，自己免疫性疾患の多くで，自己抗体は自己抗原の広い領域を認識するため，患者間あるいは患者内でも，多く異なった抗体が産生されると考えられてきた．そこで，患者内で，どのくらいの数のNC16aを認識する抗体が産生されているか，あるいは患者間で同じ部位を認識する抗体なら可変領域の非常に類似したものになっているのかを解明するため，以下の実験を計画し，当科通院中のBP患者から検体を提供頂き，マウスの実験に取り組んでいる．
1)BP患者のB細胞をEBウイルスで株化後，自己抗体産生細胞を選択，産生抗体の可変領域アミノ酸配列を解析する．
2) 患者リンパ球のB細胞受容体遺伝子の可変領域配列を次世代シークエンサーにて網羅的に取得し，B細胞クローンの種類や頻度を検討するレパトア解析を行う．
3)自己抗体可変領域のアミノ酸配列を質量分析にて直接解析する．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで我々のグループはBPの研究に取り組み，研究成果を報告してきた．2020年度はコロナ禍のため，弘前市でクラスター発生時は電話診療で対応，発熱した場合や濃厚接触者等に該当した場合は受診できないため，予定通り採血できないこともあった．そのため，重症度に関わらず，当科を受診され，同意いただけた場合に，検体を頂き，できるだけ多くの検体で自己抗体可変領域のアミノ酸配列を質量分析できるよう取り組んでいる．
近年，ペプチドの質量分析からアミノ酸の配列を予測できるようになっており，本研究ではBP180のNC16aアフィニティーカラムと抗体の可変領域を選択的に集める方法（nSMOL法）を使用することとしている．すなわち，患者の血清からBP180NC16aのカラムを用いて，抗BP180 NC16a抗体を回収し，抗体をFc末端でビーズに固定し，Fab領域（可変領域を含む）を選択的に酵素消化して得られたFab由来ペプチド断片をそのままLC/MS/MSにて質量分析を行い，可変領域のアミノ酸配列やその頻度を決定することとしている．
尚，本研究に必要な研究機器については，シークエンサー，蛍光顕微鏡，蛍光・発光プレートリーダー，その他一般的な機器についてもすべて弘前大学皮膚科専用のものがある．また，リアルタイムPCR，共焦点レーザー顕微鏡，フローサイトメトリーも共同実験施設に数台そろって，これまで使用してきている．さらに，昨年度開設された健康未来イノベーションセンターの，次世代シークエンサーや質量分析機器も使用可能であり，おおむね順調に進展している．
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究のような，BP患者において自己抗体の可変領域の解析を，実際の症例で行った研究報告は，研究代表者の知る限り、国内外を含めてない．これまで，NC16aドメインをカバーするように，短いペプチドを作成し，抗体がNC16a領域のさらに細かい部位を特定しようする試みはあるが，患者の自己抗体は，種々のクローンが混じている可能性があり，実際には結果の解釈は難しい．現時点では、
1)患者からリンパ球を採取し，EBウイルスを用いてBリンパ球をトランスフォームし，患者Bリンパ球のライブラリーを作成する過程をイーベック社に依頼予定であったが，BP患者のB細胞をEBウイルスで株化する過程が順調に進んでおらず，学内の研究者から意見を募り，引き続き取り組む．
2)患者リンパ球のB細胞受容体(BCR)遺伝子はゲノム上では多数のV（variable），D（diversity），J（joining）およびC（constant）の遺伝子断片からなる．そこで，活動期の患者からB細胞を分離し，mRNAからcDNAを合成し，非バイアス遺伝子増幅にて，BCR遺伝子を増幅し，次世代シーケンサーにて，500-600 bp.のロングリード解析行い，レパトア解析をする予定だが，現在，活動期の患者からB細胞を分離し，mRNAからcDNAを合成できるよう取り組んでいる．今後もBP活動期の患者からB細胞を分離し，mRNAからcDNAを合成後，全BCR遺伝子を増幅する予定である。尚，委託ではなく当院の次世代シークエンサーにて行うことを検討している．
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