2020 Fiscal Year Research-status Report
乳歯歯髄幹細胞培養上清由来因子を用いた新規皮膚炎治療法の検討
| Project/Area Number |
20K08690
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokushima |
|---|
Principal Investigator |
橋本 登 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (90712365)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加納 史也 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (40801626)
杉浦 一充 藤田医科大学, 医学部, 教授 (70335032)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | 炎症性皮膚疾患 / Atopic dermatitis / 乾癬 / Siglec-9 / 抗炎症 / 皮膚バリア |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト歯髄幹細胞培養上清(SHED-CM)において同定された分泌型Siglec-9(sSiglec-9)による炎症性皮膚疾患に対する抗炎症・皮膚バリア再生効果を検討するために以下の検討を行った。
まず、卵白アルブミン(OVA)誘導アトピーマウスに対しsSiglec-9の尾静脈投与をおこなった。その結果、sSiglec-9投与群では対照群に比べ、皮膚の肥厚や肥満細胞の誘導を抑制し抗炎症効果があることが示された。次に、sSiglec-9のターゲット細胞を明らかにするために次の実験を行った。イミキモド誘導乾癬マウスを作成し、脾臓を抽出しT細胞とマクロファージに対するsSiglec-9の結合性を評価した。その結果、未発症のマウス脾臓T細胞ではCD3+CD4-、CD3+CD4+T細胞共に弱陽性であったが、感染発症マウスではCD3+CD4-T細胞でsSiglec9の結合性が亢進することが分かった。マクロファージでは未発症脾臓マクロファージではF4/80+CD86-(M0)、F4/80+CD86+(M1)共に弱陽性だが、乾癬マウスではM0、M1マクロファージ共に結合性が亢進していた。現在、結合時における薬理活性の解析を行っている。
Siglec-9のリガンド糖鎖キャリアタンパクの同定を行うために、細胞溶解サンプルにSiglec-9-Fcを加えProtein A beadsでpull-downした産物に対し、そのタンパク成分のLC/MSによる網羅的解析を行った。さらに、M0、M1、M2マクロファージを調整し、それらの細胞膜タンパクを抽出しLC/MS解析を行い特異的なタンパクリストを作成した。これら２つの蛋白リストからSiglec-9結合特異的なタンパクを絞り込み、その意義を検討している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Siglec-9のターゲット細胞の同定を進めている。T細胞、マクロファージ共に炎症発症時に特徴的にSiglec-9の結合性が亢進することが分かった。特にマクロファージでの結合がより強くなることから、単球系の細胞により強く関与することが示唆されている。Siglec-9結合タンパクの同定においても既にタンパクリストは完成している。このリストから機能的な分子を見出すことで炎症性皮膚疾患の新規制御法の創出ができる可能性が高い。これまでに報告のなかったアトピーマウスでのsSiglec-9の効果を新たに発見したことからおおむね順調に進展していると考えられる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
ADにおいてsSiglec-9は種々の炎症性サイトカインを抑制していることはわかっているが、マクロファージをM1型からM2型、naive CD4+ T(ヘルパーT)のTregへの分化を誘導しているかどうかはわかっていない。B細胞、好中球、樹状細胞、肥満細胞、表皮細胞はADにおいて病態関連の細胞であり、sSiglec-9の標的になりうるため解析する必要がある。sSiglec-9のマクロファージとT細胞制御、さらにB細胞や樹状細胞、表皮細胞等への影響を体系的に解析し、細胞上の結合分子および作用メカニズムを明らかにする必要がある。
皮膚バリアの維持にはFilaggrinの正常な発現が寄与している。sSiglec-9投与マウス表皮のFilaggrin 発現をreal time PCR法および抗体染色により解析する。また、ビオチンを皮膚部に塗布し、その膚透過量で皮膚バリアの構造評価を行うことができる。そこで、治療、未治療群のビオチン取り込みをavidin染色により評価する。TNFaやIFNgによりHaCaT細胞のThymus and activation regulated Chemokine (TARC)が誘導される。TARCの発現は皮膚バリアの崩壊につながる。sSiglec-9がTARC発現抑制可能かどうかを検討する。その際、Filaggrin以外の皮膚バリア因子であるTight Junction関連分子の発現解析、さらにセラミド合成への影響を薄層クロマトグラフィー法による脂質解析を行う。
|
| Causes of Carryover |
研究計画の実施スケジュールに変更があったため次年度使用額が生じた。
該当の実験計画については翌年度に実施し、使用する。
|
