2020 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of coagulation and fibrinolytic functions and vascular endothelium-platelet interaction using disease-specific iPS cells
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20K08710
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
佐野 秀人 浜松医科大学, 医学部, 助教 (80623842)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浦野 哲盟 浜松医科大学, 医学部, 特命研究教授 (50193967)
鈴木 優子 浜松医科大学, 医学部, 教授 (20345812)
田中 宏樹 浜松医科大学, 医学部, 特任研究員 (50456563)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 疾患特異的iPS細胞 / 血管内皮細胞 / 血小板 / 凝固線溶系 / 遺伝子編集 / 血管新生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでiPS細胞の維持について、フィーダー細胞との共培養にて行ってきたが、培養系の改善に伴いフィーダーフリーの状態での分化維持の効率が上がったため移行した。移行に伴い、分化効率が変化したため、内皮細胞分化においても分化方法の改善について検討を行っている。これまでは間質細胞であるOP9との共培養により中胚葉系を誘導しVEGF投与により内皮細胞に分化させVEGFR2抗体で内皮細胞をソートしてきたが、Kimら（Tissue Eng Part A. 2013）の方法を元に、Wnt/beta-Cateninの系を刺激することにより中胚葉系に分化させCD34陽性細胞をソートしたあと内皮細胞培養用培地での培養を試している。今後はこの方法を用いて平滑筋細胞も分化させることができるので、血管系細胞との相互作用に用いることができると考えている。
iPS細胞から血小板への分化については、マウスの線維芽細胞株である10T1/2細胞を用いて行うため、この分化の条件検討を行っている。巨核球分化から血小板分泌系のより効率の良い分化系を既報を元に試行を行っている。
現在、内皮細胞株（EA.hy926）にてCRISPR/CAS9を用いたPAI-1欠損細胞を樹立して解析している。CRISPR/CAS9は非常に効率よく遺伝子編集が可能なため、本プロジェクトにも採用を考えており、巨核球細胞株であるMEG-01細胞の培養を開始し、血小板分化の方法の確立を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本プロジェクトでは、iPS細胞由来血管内皮細胞の分化効率化は非常に重要なポイントである。この条件検討は、既報を元に現有設備での再現化を図っており、未だに完全ではないが整備されつつある。遺伝子欠損iPS細胞は、疾患として既に表現系として示されていることから、疾患特異的iPS細胞の解析を行うことは重要であり、またiPS細胞からの分化過程の細胞（前駆細胞等）の影響も考慮でき、有効なツールである。一方、細胞株は短所もあるが、細胞培養方法やCRISPR/CAS9等での遺伝子操作の簡易さ、細胞成熟度の均一性など長所も多々あり、こちらも有効なツールである。iPS細胞での解析と、細胞株を用いた遺伝子操作細胞を同時並行で解析していくことを考えている。そこで血小板分化で有用なMEG-1巨核球細胞の培養を開始し、トロンボポエチン等による分化の実験系の確立に着手し始めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
①フィーダーフリーiPS細胞から効率よく分化させた血管内皮細胞の内皮細胞機能の確認を行っていく。②コントロール分化細胞とPAI-1欠損iPS細胞由来分化細胞の比較を行う。③iPS細胞より血小板への分化系の確立。④血管内皮細胞上での血小板の機能解析（凝固線溶解析）。⑤in vitroマイクロ流路システムによるin vivoに近い系での解析
以上、順路建てて効率よく作業を進め、結果を得ていく。
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| Causes of Carryover |
本年度予定していたiPS細胞から内皮細胞及び血小板分化の詳細な条件検討を行っており、この部分に多くの時間を費やした。内皮細胞のより効率良い分化方法について検討したため、血小板分化に使用予定だった予算を内皮細胞分化に一部を割いた。その他、CRISPR/CAS9にてゲノム編集した内皮細胞株については、別予算で細胞樹立し、細胞解析を行ったが、この細胞の本プロジェクトへの転用も考えており、この条件検討を本年度予算に用いた。
申請書に示した通り、iPS細胞の巨核球分化・血小板分化系の樹立と解析に使用していく予定である。
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