2021 Fiscal Year Research-status Report
血小板活性化受容体CLEC-2を標的とした抗体医薬の開発とその薬理作用の解明
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20K08729
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
佐々木 知幸 山梨大学, 大学院総合研究部, 准教授 (40739124)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 克枝 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (10324211)
築地 長治 山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (20710362)
白井 俊光 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (50710381)
大竹 志門 山梨大学, 大学院総合研究部, 医学研究員 (50813060)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | CLEC-2 / 血小板 / 抗体医薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，臨床応用可能な抗CLEC-2薬の開発を目指し，すでに見出した抗体を基盤に，近年の抗体改変技術を応用して血小板活性化能の欠失やフラグメント化などにより血小板減少などの副作用の問題を解決し，同時に，血小板CLEC-2の欠損メカニズムも解明することである．
令和3年度では，ハイブリドーマrat2A2B10とrecombinant mouse chimeric 2A2B10 (rm2A2B10）をマウスへ投与し，血小板CLEC-2の免疫学的欠損の有効期間を比較した．その結果は，ハイブリドーマrat2A2B10の有効期間がrecombinant体よりも長いことを示した．しかし，産生効率や細胞の違いなどで正確な比較になっていないと考え，ratとmouse由来の重鎖(HC)と軽鎖(LC)を構築し，さらにコドンの最適化も行い検証したが，明らかな有効期間の延長や収量の改善は認めなかった．recombinant体の合成法については，細胞への遺伝子導入法をエレクトロポレーションからPEI法に変更するなどして，収量の増加とランニングコストを抑えることが可能となった．
また，抗CLEC-2抗体(クローン名2A2B10)の抗原認識部位を検証するためにエピトープ解析を行った．その結果，エピトープは膜貫通領域に近いN末端領域であるアミノ酸57～140番目であると推定した．その他の欠損変異体についても検証を進めている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和3年度において，2A2B10抗体のマウス化とマウスにおける免疫学的血小板CLEC-2欠損の効果の検証を完了した．マウスを使用した検証のためには，多くの抗体を必要とし，収量の改善に若干成功したが，多くの時間が抗体作製に費やされている現状があった．そのため，進捗状況はやや遅れていると判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
①マウス化あるいは完全マウス抗体の作製：recombinant 2A2B10(ratやmouseのHCとLCの組み合わせ発現)の比較でマウスキメラ化が有効期間を延長させなかった原因としては、rat由来の残存配列がまだ多いという可能性や、血小板膜タンパクに対する抗体の場合、抗原提示されやすいという可能性を考えた．そこで，recombinant CLEC-2をマウスに免疫し，マウスモノクローナルanti-CLEC-2抗体を得た後に，2A2B10のエピトープ認識部位と入れ替えることで，完全マウス抗体の作製を試みる．
②2A2B10抗体のエピトープ解析：引き続きではあるが，発現ベクターを構築済のCLEC-2の各種欠損変異体を用いて，2A2B10抗体の認識部位を同定し，抗体医薬開発のための基礎情報とする．
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Research Products
(7 results)
