活性化プロテインCおよびプロテインS制御による安定化第VIII因子製剤の開発

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08760
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 武山 雅博 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (30572010)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野上 恵嗣 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (50326328)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 第VIII因子 / 活性化プロテインC

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、FVIIIを中心とした凝固・抗凝固機能のさらなる解明と、抗凝固機能を受けにくい変異FVIIIを作成することにより、安定型・長時間作用型 FVIII製剤へ応用することである。我々が目指す新規FVIII製剤は、活性化プロテインC(APC)/プロテインS(PS)の結合部位を変異させた全く新たな機序による製剤 である。新規FVIII製剤はAPC/PSと の結合能が弱く、APC/PSにより不活化されにくいため、従来のFVIII製剤より安定性が高く、長時間作用すると考えられる。 これまでに、FVIII上のAPC結合部位 の詳細な同定を行い、APCがFVIII軽鎖(A3ドメイン)アミノ酸残基2007-2016に結合することを示した。これらの研究をもとに、FVIII重鎖(A2ドメイ ン)上の新規APC結合部位の同定について研究を行った。SPR-assayにより、DEGR-APCと400-429ペプチドが結合し、同領域がAPCの結合部位であることが示唆された。FVIIIはAPCにより開裂を受け、不活化されるが、その不活化が420-429ペプ チドの存在により阻害されるかを検討した。420-429ペプチド存在下ではFVIIIのAPCによる不活化は、420-429ペプチド非存在下と比べて低下しており、420-429ペプチドがAPCの 作用を阻害することを示した。さらに、APCと420-429ペプチドが、EDC クロスリンカーにより結合するかをWestern blottingを用いて検討を行い、APCと420-429が直接結合することが明らかになった。さらに、western blottingによ りAPCと420-429ペプチドをEDCクロスリンカーさせたbandを、アミノ酸シークエンスすることを試みたが、得られたバンドが非常に薄く、アミノ酸シーケンスを断念した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

APCと420-429ペプチドが、EDCクロスリンカーにより結合するかをWestern blottingを用いて検討を行い、APCと420-429が直接結合することがわかったが、アミノ酸シーケンスを行う事ができず、FVIIIのアミノ酸残基420-429のどのアミノ酸がAPCと結合するのかを同定することができなかった。これまでのFVIIIとプロテインSとの結合部位の同定やFVIIIとFXとの結合部位の同定の研究結果から、FVIII と他の凝固因子・抗凝固因子はFVIII上の塩基性あるいは酸性アミノ酸と結合することが多いとわかっている。現在、アミノ酸残基420-429のうち、塩基性アミノ酸であるR421, K422, K424, K425, R427をアラニンに変異させた変異FVIIIをベビーハムスター腎臓細胞を用いて発現させ、蛋白の精製に成功したが、一部の変異FVIIIは回収量が非常に少なく、精製に難渋した。

Strategy for Future Research Activity

本年度は精製した変異FVIII（R421A, K422A, K424A, K425A, R427A）を用いて以下の検討を予定している。
①APCによる変異FVIIIの開裂をwestern blottingで検討する
②変異FVIIIのAPCによる不活化をFXa生成試験で検討する
③変異FVIIIとAPCの結合能をSPR-based assayで検討する
これらの検討により、FVIIIのAPC結合部位を詳細に明らかにする予定である。

Causes of Carryover

研究機関を延長したため、次年度に購入する消耗品のため次年度使用額が生じた。
本年度に消耗品を購入する予定である。