2020 Fiscal Year Research-status Report
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20K08767
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
住田 孝之 筑波大学, 医学医療系, 客員教授 (00183054)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | シェーグレン症候群 / 膠原病学 / iPS細胞 / Th1細胞 / Treg細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シェーグレン症候群(SS)は、口腔内乾燥感、乾燥性角結膜炎、関節炎を主症状とする全身の炎症性疾患であり、厚労省指定難病の一つに認定されている免疫難病である。SSの発症には、各臓器に浸潤したCD4+T細胞の役割が重要である。私たちは浸潤T細胞抗原受容体(TCR)及び対応抗原の解析から、アセチルコリン作働性ムスカリン受容体3(M3R)を認識するTh1細胞及びTh17細胞がSSの発症に重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。
本研究では、M3R反応性Th1及びTh17細胞の機能をTreg細胞に変化する誘導分子を検索し、疾患特異的治療戦略の開発を目的とする。その方法は、SS患者からM3R反応性T細胞(Th1、Th17)を分離し、iPS細胞化する(T-iPS)。次にT-iPS細胞をin vitroで抑制性T細胞（Treg）に分化誘導する。iPS細胞を利用することにより同一TCR遺伝子を有するM3R反応性T細胞の機能転換（Th1、Th17→Treg細胞）が可能である。Th1、Th17、Treg細胞の発現遺伝子に関して網羅的に解析することによりTreg細胞への機能転換分子を検索する。得られた分子の機能をin vitroにおける分化誘導系において、Th1→Treg細胞、Th17→Treg細胞への機能転換分子であることを確認する。
本研究のユニークな点は、T-iPS細胞を用いる事でT細胞の再構成されたTCRが保持され、M3R抗原特異性が維持される実験系の確立ができ、T細胞の機能転換に関わる分子の検索が可能となる点である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1)SS患者(HLA-A24, A31, DRB1 14:54, DRB1 15:02)末梢血から、M3R反応性Th1細胞(IFN-γ産生)をフローサイトメトリー法を用いて分離し、35個のクローンを樹立した。2)1)で樹立した5個のTh1細胞クローンに山中4因子をセンダイウイルス法で遺伝子導入し、8個のT-iPS細胞株を樹立した。3)樹立したT-iPS細胞が有するTCR遺伝子が、iPS細胞化する前のTh1細胞クローンと同一の再構成したTCRVβ遺伝子、TCRVα遺伝子であることをsequence法で確認した。4)T-iPS細胞からSac法を用いてCD34+細胞を誘導し、GM-CSF/M-CSFで14日、次にGM-CSF/IL-4で7日刺激を加えることでDC細胞への分化誘導に成功した(Stem Cell Reports. 2017)。この細胞を応用することによりT-iPS細胞をin vitroで分化誘導することが可能となった。5)T-iPS細胞をin vitroでCD34+CD43+細胞に分子誘導し、NSGマウスに細胞移入することにより、60日目のマウス末梢血においてヒト由来CD4+T細胞への分化を確認することができた。しかし本研究は再現性に乏しかった。一方、ヒト臍帯血からのfoxp3+Treg細胞への誘導には成功した（Clin Exp Immunol. 2021）。6)In vitroにおいて、ヒトmemory CD8+T細胞からCDK8/19 inhibitor(CCT251921)を用いてCD8+Treg細胞に誘導することに成功した（in preparation）。7)50%のSS患者末梢血にM3R反応性Th17細胞が存在することをELI-SPOT法で明らかにしてきた(J Clin Invest Insight. 2020)。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.Th1→Treg細胞プロジェクト：
1)CD4+Treg細胞の誘導：T-iPS細胞をin vitroでCD34+CD43+細胞に分子誘導し、NSGマウスに細胞移入することにより、in vivoにおいてヒト由来CD4+T細胞及びCD4+Treg細胞を誘導する。2) CD8+Treg細胞の誘導：T-iPS細胞を対象として、CDK8/19 inhibitor(CCT251921)を用いてin vitroにおいてCD8+Treg細胞を誘導する。3)Th1→Treg細胞転換分子の解析：M3R反応性Th1細胞及びT-iPS細胞から誘導されたM3R反応性Treg細胞を対象として、RNA-seq法、DNA array法などを用いて、Th1細胞をTreg細胞に機能転換する分子Xを解析する。4)分子Xの機能を検証：in vitroにおいて、M3R反応性Th1細胞に分子Xを添加することによりTreg細胞に機能転換することを確認する。
2.Th17→Treg細胞プロジェクト：
1)M3R反応性Th17細胞由来T-iPS細胞の樹立：SS患者末梢血からフローサイトメトリーを用いてM3R反応性Th17細胞を分離しT-iPS細胞を作成する（東大医科研谷口英樹研究室との共同研究）。2)CD4+Treg細胞、CD8+Treg細胞の誘導：上記1-1)、1-2)と同様の方法により、T-iPS細胞からCD4+Treg細胞、CD8+Treg細胞を分化誘導する。3)Th17→Treg細胞転換分子の解析：M3R反応性Th17細胞及び誘導されたTreg細胞を対象として、上記1-3)と同様の方法でTh17細胞をTreg細胞に機能転換する分子Yを解析する。4)分子Yの機能を検証：in vitroにおいて、M3R反応性Th17細胞に分子Yを添加することによりTreg細胞に機能転換することを確認する。
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Research Products
(7 results)
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[Presentation] Detection and clinical significance of circulating M3 muscarinic acetylcholine receptor (M3R) reactive Th17 cells in patients with primary Sjogren's syndrome.2020
Author(s)
Abe S, Tsuboi H, Honda F, Takahashi H, Kurata I, Ohyama A, Yagishita M, Hagiwara S, Kondo Y, Matsumoto I, Sumida T.
Organizer
第64回日本リウマチ学会総会・学術集会
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