2020 Fiscal Year Research-status Report
組織炎症と繊維化に対するT細胞由来のプロテオグリカンの解析
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20K08769
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
岩村 千秋 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任講師 (10513062)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | プロテオグリカン / セルグリシン / 線維化 / 慢性炎症 / アレルギー性気道炎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、CD4T細胞由来のセルグリシンが組織の線維化の起点なりうる可能性ついて研究し、その機序を分子細胞免疫学の観点から解析している。
(i)セルグリシン産生Th2細胞のアレルギー性気道炎症における役割：セルグリシンを過剰発現した抗原特異的Th2細胞を野生型マウスに移入し、抗原の投与により肺の炎症を評価した。その結果、野生型のTh2細胞移入群よりセルグリシンを過剰発現したTh2細胞移入群の方が、顕著な浸潤細胞数の上昇が認められた。このことはTh2細胞の産生するセルグリシンが炎症の増悪に関与していることを示唆している。
（ii）セルグリシンに結合するGAGの同定とアレルギー性気道炎症への影響：炎症肺から調整したCD4T細胞をSingle cell-RNA-sequencing解析によりGAGの糖鎖伸張に関わる種々の糖転移酵素や硫酸基転移酵素の発現を網羅的に調べた。主にヘパラン硫酸伸長酵素の1つであるExt1の発現が正常肺中のCD4T細胞と比べて顕著に増加していた。
（iii）肺線維化におけるプロテオグリカンの関与：CRISPER-Cas9システムを用いてセルグリシンノックアウト(KO)マウスとセルグリシンコンディショナルノックアウト(cKO)マウスを作成した。またExt1 floxマウスを入手して、CD4T細胞特異的にヘパラン硫酸の伸長酵素であるExt1が欠失したマウスを作成した。
（iv）T細胞におけるプロテオグリカンの局在とその機能の検討：代表的なGAG鎖であるコンドロイチン硫酸やヘパラン硫酸は電気的に負に帯電しており、正の電荷を帯びるIL-4やIL-5などのサイトカインと結合し、その細胞内における滞留に関与することを予想した。しかし、組織免疫染色法によりセルグリシンとこれらサイトカインの局在は異なっており、セルグリシンKO細胞のサイトカイン産生に変化は認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、セルグリシンの慢性アレルギー性気道炎症反応において、炎症の遷延化と組織線維化の関与について検討を行っている。炎症組織におけるセルグリシンの発現増加が、炎症の抑制または亢進のどちらに作用しているのかはこれまで不明であった。今回CD4T細胞のセルグリシンの過剰発現により、炎症の増悪が認められたことから、それは病的に作用する事が明らかとなっている。このことをさらに検証するため、作成したコンディショナルマウスを作成し、現在in vivo実験に使用できるまで繁殖を行っている。セルグリシンはこれまでの報告からマスト細胞内においてその顆粒などの保持に必要である事が知られている。CD4T細胞においても、サイトカインなどの保持などに関与しているのかノックアウト細胞を用いて調べた結果、その産生量には影響がなかった。したがって、セルグリシンの病的な役割は別の可能性があると考えられる。
これまでの結果から、アレルギー性気道炎症モデルの肺血管周囲においてヘパラン硫酸の沈着が確認されている。今回Single cell RNA-seq解析により、ヘパラン硫酸の伸長酵素であるExt1の発現が炎症により増加している事がわかった。したがって、炎症肺におけるヘパラン硫酸を産生する細胞の1つはCD4T細胞である可能性が示唆されている。
以上着実な研究進展が認められており、概ね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) Th2細胞由来のセルグリシンが肺の炎症悪化に関与していることが明らかとなったことから、今後はセルグリシンのCD4特異的欠損マウスを使用し、肺の炎症症状が野生型と比べて減弱するのか確認する。またセルグリシン阻害抗体をアレルギー性気道炎症マウスに投与し、症状改善が認められるか検討する。
(2) Th2細胞にはヘパラン硫酸が主に産生されているのが明らかとなったが、今後はグライコーム解析により、構成している糖鎖配列を詳細に検討する。またTh2細胞に発現しているヘパラン硫酸のコアタンパク質としてセルグリシンが用いられているのかを検証する。
(3) セルグリシンKO、セルグリシンcKOまたはExt1 cKOマウスに、ハウスダストまたはアスペルギルス抗原の長期曝露による肺の線維化を誘導する。肺の組織学的な解析に加えてハイドロキシプロリン量の測定など、線維化の程度を野生型マウスと比較する。この実験によりCD4T細胞の産生するセルグリシンやヘパラン硫酸の組織線維化における役割を明らかにする。
(4) 細胞内におけるサイトカインの滞留にセルグリシンは関与しなかったことから、分泌性タンパクであるこの分子の細胞外における役割について検討を行う。CD44はセルグリシンの結合タンパク質と知られ、また活性化CD4T細胞やメモリーCD4T細胞に高発現している分子である。またコラーゲンなどの細胞外基質もセルグリシンの結合タンパク質として知られていることから、活性化CD4T細胞はセルグリシンを分泌し、細胞表面のCD44と細胞外気質のコラーゲンとを架橋することで細胞の組織への滞在を促進すると予想する。このことを検証するために、セルグリシンKOマウスを用いてCD4T細胞の炎症組織における集積を調べる。
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