2020 Fiscal Year Research-status Report
多剤耐性菌の脅威に対するバクテリオファージ療法の新規効果機序の解明
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20K08826
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
松田 剛明 杏林大学, 医学部, 教授 (80365204)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
花輪 智子 杏林大学, 医学部, 教授 (80255405)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | MRSA / ファージ療法 / 創傷感染 / 免疫修飾 / 炎症性サイトカイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ファージを感染症の治療に用いて安定した効果を示すために、新たなファージの単離や細菌の免疫系の解析とそれ不応答化した変異ファージの作出などが進められている。一方、感染部位では、細菌とファージの相互作用に加え、宿主に対するファージの相互作用も生じることから、ファージ投与による宿主免疫系に対する影響を明らかにすることは重要となるが、未だその報告は少ない。そこで本研究では、ファージ投与による宿主に対する影響を解析する。
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）創傷感染モデルは、ファージのマウスの背面に皮膚切除部位を作成し、MRSAを接種した創傷感染モデルを用いた。これまでの研究から、感染が成立し、膿瘍が形成された後にファージを投与してその治療効果を調べた際、粗精製ファージを用いた場合には治療効果が認められたが、精製ファージではその効果が消失した結果を得ている。粗精製のファージ（ファージライセート）にはファージと細菌の溶菌片が含まれており、それがファージの治療効果に影響を与えている可能性がある。
一方、ファージに対して感受性を示す臨床分離株KYMR116をマウス創傷感染に用いた場合、菌の接種３０分後にファージを投与した場合には生菌数は顕著に減少し、膿瘍の形成がみられない。一方、非感受性を示す臨床分離株であるKYMR58をマウス創傷感染に用いた場合にも一定の菌数の減少がみられた。そのことからファージは菌との相互作用以外にも宿主に対して何らかの影響を及ぼし、治療効果を増強する作用を示す可能性がある。そこで本課題では、ファージ投与による宿主の免疫系に対する影響を解析する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本課題では、当初ファージライセート中のファージの存在様式を解析する予定であったが、2020年度にはコロナウイルスの感染拡大による移動制限、研究設備使用制限などが行われ、計画に従って実施することが困難となった。
そこで精製ファージを用いた検討を行い、ファージそのものの影響を調べることに変更した。
その結果、ファージ非感受性菌を用いた感染実験において、同時投与による菌数の減少、炎症性サイトカインの産生低下などがみら、その効果は粗精製および精製ファージの間で有意差が認められなかった。
その結果を受けて精製ファージを用いた宿主免疫反応に対する影響を調べることとした。
ファージそのものにも宿主に対して何らかの影響を及ぼすことが示唆されたため、それを精査する目的で、ファージ感受性菌であるKYMR116および非感受性菌であるKYMR58を感染に用い、創傷感染部位の生菌数の推移と炎症性サイトカインであるIL-1βおよびIL-6の産生量を継時的に調べたところ、24時間後にはその生菌数が1/105まで減少したのに対し、ファージ非感受性菌の場合にも1/100まで減少した。さらにIL-1βもIL-6もファージ投与により顕著に減少し、集積した好中球量も減少したが、その違いはKYMR116で顕著であった。
一方、ファージとKYMR116を長期間共培養することでファージ耐性菌を得た。その形態をグラム染色で観察したところ、菌のサイズが小さくなっており、液体培養中に沈殿を形成し易いなど、表層構造に変化が生じたものと考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度に行った実験では、ファージ非感受性菌の感染モデルにおいても精製したファージを投与することで生菌数を減少させ、炎症性サイトカインの産生も抑えた。そこで2021年度にはその効果の機構を解明する。
KYMR58はファージに非感受性の臨床分離株である。この菌のファージ耐性機構は今のとこ不明であり、結合しても複製しない可能性がある。ファージのKYMR58に対する結合活性は菌の貪食等に影響を与えるものと予想される。そこでファージのKYMR58に対する結合能を調べる。
炎症を惹起するシグナルに最初に応答する主要な細胞の一つはマクロファージである。そこでマクロファージ系培養細胞株であるJ774.A1、RAW264.1およびマウス骨髄由来のマクロファージを用いて、ファージ添加による貪食能およびサイトカイン産生に対する影響を調べる。また、黄色ブドウ球菌感染症では好中球が多く集積し、それによる炎症反応が感染症の病態形成に重要な役割を果たしていることが知られている。そこでマウス骨髄由来の好中球に対するファージの影響も調べる。
また、感染のない傷に対するファージ投与の影響をサイトカインの産生および免疫組織染色により調べ、組織損傷により惹起された炎症反応に対するファージの影響を調べる。
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| Causes of Carryover |
支払いにより生じた端数であり、新たに物品を購入するには及ばなかったため、2021年度の消耗品購入時に使用する予定である。
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Research Products
(3 results)
