2021 Fiscal Year Research-status Report
Study on mechanisms of rubella virus infection to the fetus, possible alternative cellular receptors and factors affecting the virus infection
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20K08829
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
早川 智 日本大学, 医学部, 教授 (30238084)
相澤 志保子 日本大学, 医学部, 准教授 (30513858)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 風疹ウイルス / ヒト不死化絨毛細胞 / 小胞体ストレス / TGF-β1 / 上皮間葉転換 / 低グルコース |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1/.風疹の経胎盤感染は臨床的に重要な問題であるが、その機序は不明である。本研究ではin vitroで風疹ウイルスがヒト不死化絨毛細胞HTR-8/SVneo・Swan.71に低感染性を持つことがわかり、その研究結果をまとめ、原稿に書き、英文で発行されている国際的Virusesジャーナルに投稿した。
2/. 小胞体ストレスはヒト不死化絨毛細胞を風疹ウイルス感受性にする研究：ヒト不死化絨毛細胞HTR-8/SVneo・Swan.71細胞を低グルコース（0.5 mM）や高グルコース(25 mM)など様々な小胞体ストレス処理した後にMOI 5～10 で、風疹ウイルス（臨床分離株）に感染させた。感染後24時間および48時間後（hpi）に、フローサイトメトリー(FCM)や蛍光顕微鏡で風疹ウイルスカプシドタンパク質の局在を確認し、培養液中でのウイルス抗原を定量した。HTR-8/SVneo・Swan.71細胞のアポトーシスを FCMで検討した。また、ウイルス結合アッセイを行い、ウエスタン・ブロッティング法やFCM法によりウイルスのバインディングを調査した。その結果、未処理のヒト不死化絨毛細胞HTR-8/SVneo・Swan.71細胞には風疹ウイルスは低感染性であるが、低グルコースによる小胞体ストレスを受けることによって、24hpiより、FCMで、48 hpiでは蛍光顕微鏡でウイルス抗原の染色を増加した。しかし48 hpiにおいても風疹ウイルス感染細胞の有意なアポトーシスの増加は認めなかった。上清中へのウイルスの粒子の産生は24時間から5日間継続して認められた。以上の結果をまとめ、「低グルコースによる小胞体ストレス下で、ヒト不死化絨毛細胞に風疹ウイルスの感染に上昇する」と題する原稿に執筆し、「Frontier in Microbiology」ジャーナルに投稿した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
風疹ウイルスが人不死化絨毛細胞(HTR-8/SVneo、Swan.71)に低感受性を持つことをことを明らかにし、その研究結果の原稿を国際的Virusesジャーナルに投稿した。
感受性及び非感受性細胞への風疹ウイルス感染に影響を与える可能性のある要因についての研究には、低グルコースによる小胞体ストレス下で、不死化絨毛細胞に風疹ウイルスの感染に上昇することを認めた。従来、胎盤の細胞は風疹ウイルス非感受性と考えられてきたが、特定の条件では風疹ウイルスに感染し持続的にウイルスを産生する。我々の知見は、妊娠中の低グルコースにより小胞体ストレスがtrophoblastを風疹ウイルス感受性に変換することを明らかにした。風疹の子宮内感染機序の解明に一石を投じる可能性がある。以上の研究結果を学会で発表・報告し、その原稿もFrontier in Microbiologyジャーナルに投稿した。
またin vitroでの培養時間により、人不死化絨毛細胞Swan.71細胞に風疹ウイルス感染率の変更の事がフローサイトメトリー法により認められた。
さらに、初年度の研究結果の内、ヒト肺胞上皮由来であるA549細胞をTGF-β1で刺激して上皮間葉転換（EMT）が風疹ウイルスの感受性を上昇したことを認め、以上の結果を学会で発表・報告し、国際的Microorganimsジャーナルで公表した。
以上のことから、初年度に予定した実験は概ね順調に進行しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
1/. 感受性及び非感受性細胞への風疹ウイルス感染に影響を与える可能性のある要因についての研究：令和3年度の研究結果では、低グルコースによる小胞体ストレス下で、ヒト不死化絨毛細胞に風疹ウイルスの感染に上昇することを認めたので、今後の研究には、そのメカニズムを解明する。ヒト不死化絨毛細胞HTR-8/SVneoやSwan.71細胞を培養し、低グルコースストレスを誘導させ、その小胞体ストレスの抑制剤（Calpain Inhibitor III、NMDA antagonistなど）を加え、ウイルス感染実験を行う。感染後24時間および48時間後にフローサイトメトリー法によるウイルス感染率を評価する予定である。また、酸化ストレス、栄養飢餓などはウイルス感染に影響を及ぼす可能性があるため、これらの負荷を栄養膜細胞にかけた状態で、風疹ウイルスの感受性を評価する。
2/. 栄養膜細胞への風疹ウイルス感染における上皮間葉転換（EMT）やTGF-β1の関与に対する研究：令和3年度の研究の結果では、in vitroでの培養時間により、人不死化絨毛細胞HTR-8/SVneoやSwan.71細胞に風疹ウイルス感染率の変更のことがフローサイトメトリー法により認めた。今年度は引き続き、LY346947、 SB431542、 SB 525334などのTGF-β1の抑制剤を用いて、そのメカニズムを解明する。
また現在投稿している原稿の追加実験などを行い、得られたデータを解析し、修正原稿を返送する予定である。さらに、今年度研究の結果及び全体的研究結果を学会で発表・報告し、原稿を書き、国際的ジャーナルに投稿する予定である。
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Research Products
(7 results)
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[Presentation] SARS-CoV-2 陽性妊婦における胎盤の免疫・病理学的検討2021
Author(s)
髙田 和秀, Trinh Duy Quang, 生田 稜, 相澤 (小峯)志保子, 羽尾 裕之, 加藤 紀子, 平田 善康, 大森 さゆ, 佐藤 美紀子, 小松 篤史, 長野 伸彦, 岡橋 彩, 高野 智圭, 馬詰 武, 下屋 浩一郎,川名 敬, 森岡 一朗, 山田 秀人, 早川 智
Organizer
第29回日本胎盤学会学術集会
