2021 Fiscal Year Research-status Report
中東呼吸器症候群コロナウイルスの免疫回避機構の解明とそれに基づく新規ワクチン開発
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20K08838
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| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
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Principal Investigator |
北川 善紀 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (00444448)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 中東呼吸器症候群コロナウイルス / MERS / 抗IFN活性 / TLR7経路 / インターフェロン / IFN / コロナウイルス / IKKα |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）のアクセサリー蛋白質が備える宿主インターフェロン（IFN）システムを妨害する能力（抗IFN能）とその分子機構を明らかにして、その能力を喪失させた弱毒ワクチンをデザインすることを目的とした。
前年度の研究により、MERS-CoVのORF4bタンパク質は、リン酸化酵素IKKαと結合し、転写因子IRF7のリン酸化を阻害することで、IFN産生を抑制していると推定された。そこで本年度は、ORF4bのIKKαとの結合領域を明らかにし、IKKα結合能を消失したORF4b変異体を作成することを試みた。ORF4b（全長1－246aa）の複数の欠損変異体を作成し、IKKαとの結合能を評価した結果、N末から61－120aaの領域がIKKαとの結合に重要であることが示唆された。続いて、作成した欠損変異体のIFN産生阻害能を評価した結果、IKKα結合能を保持する変異体はいずれもIFN阻害能を保持するのに対して、結合領域を含まない欠損変異体（121-246aa）は阻害能を喪失していた。以上の結果から、ORF4bが備えるIFN阻害活性にはIKKαとの結合が重要であることが示唆された。
続いて、ORF4bとIKKαが細胞のどこで結合しているかを評価した。核移行シグナル（NLS）をもつORF4bは主に核内に存在するのに対して、IKKαは細胞質に局在することが知られている。そこで、両タンパク質の細胞内局在を解析したところ、ORF4b発現細胞ではIKKαは細胞質から核内に移行していることが明らかになった。一方、ORF4bのNLS変異体を発現する細胞では、ORF4bとIKKαは共に細胞質に留まることが確認された。以上の結果から、ORF4bは、IKKαを核内に引き込むことで、本来の機能を制御している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画の通り、MERS-CoVのアクセサリータンパク質が備える抗IFN活性の分子機構の解析を進めた。その中でも特に、ORF4bのTLR7依存性IFN産生経路阻害機構については、IKKαとの結合や核内への隔離がIFN産生阻害に重要である可能性を見いだした。
本年度の進展状況は以下の通りである。ORF4bの各種の変異体（欠損変異体または点変異体）を作成し、各変異体のIKKαとの結合能やIFN産生阻害能、転写因子IRF7に対するリン酸化阻害能、細胞内局在を調べ、それぞれの相関を検討した。その結果は、「研究実績の概要」にも記述したように、IKKαと結合する変異体はいずれもIFN阻害能やIRF7リン酸化阻害能を保持するのに対して、結合できない変異体（121-246aa）は両阻害能をともに喪失したことから、IKKαがORF4bの標的分子である可能性が高いことを確認した。続いて、ORF4bとIKKαの細胞内局在を調べたところ、ORF4ｂは主に核内に存在し、本来細胞質に留まるIKKαを核内に引き込むことを見いだした。この結果は、ORF4bがIKKαを核内に隔離することで、IKKαのシグナル分子としての機能を妨害している可能性を示唆している。
一方、別のアクセサリータンパク質ORF8bのIFN産生阻害機構については、進展はほとんど見られなかったが、以上の点を鑑みた結果、本年度の研究は概ね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで取り組んできたORF4bおよびORF8bによるTLR7依存性IFN産生経路を阻害する分子機構の詳細について、引き続き検討していく。
具体的には、ORF4bについては、NLS変異体のIFN産生やIRF7のリン酸化または核移行などに対する阻害能を解析することで、IKKαの核内への取り込みが、ORF4bのIFN産生阻害活性に重要なステップであるかを検証する。一方、ORF8bについては、その標的分子がまだ明らかにはなっていないので、ORF8bと結合する宿主分子を免疫沈降法および質量分製法を用いて単離・同定を試みる。
また、TLR7依存性IFN産生阻害能を喪失することが確認されたORF4b変異体（121－246aa）については、他IFN産生経路（TLR3経路とRIG-I/MDA5経路）やIFN応答経路に対する阻害活性を網羅的に評価する。いずれのIFN産生経路および応答経路も阻害できないことを確認した後に、当初の研究計画に従って、同変異体を発現する遺伝子組換えウイルスの作成に着手する予定である。
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| Causes of Carryover |
RNAを扱う実験のためにピペットエイドを新規に購入する予定であったが、コロナ禍で納入時期が遅くなったため、次年度への繰り越しとなった。次年度に同製品を購入する予定である。
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