鼻咽頭定着の制御に基づく新たな肺炎球菌感染症予防法の開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K08848
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 中村 茂樹 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (20399752)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 肺炎球菌 / 鼻咽頭定着 / NKT細胞

Outline of Annual Research Achievements

肺炎球菌の鼻咽頭定着マウスモデルの再現性を確認するために、C57BL/6 (野生型)マウスおよびNKT KOマウス (Jα18 KO)に対し、肺炎球菌P1121株を経鼻感染させ、感染後3日目、7日目、21日目に鼻腔洗浄を行い、前実験同様に肺炎球菌の経時的な鼻咽頭定着菌数の推移およびNKT KOマウスにおける肺炎球菌感染21日後の鼻咽頭定着菌数の有意な増加を確認することができた。さらに肺炎球菌感染前のマウスに経鼻的にNKT細胞のリガンドであるα-ガラクトシルセラミド (2μg/匹)を腹腔内投与し、肺炎球菌感染後の鼻咽頭定着菌数を経時的に検討したところ、感染21日後の鼻腔洗浄液において定着菌数の優位な低下が認められた。侵襲性の高いD39株を用いた生存率解析では、野生型マウスよりNKT KOマウスで死亡率が高く、血中生菌数についてもNKT KOマウスで高いことから、野生型マウスと比較しNKT KOマウスで侵襲性感染症へと進展しやすいことが明らかとなった。次に鼻腔洗浄液中の免疫細胞数 (好中球数、マクロファージ数)の経時的変化を解析するために鼻腔洗浄液を用いたFACS解析を行なった。好中球はGr-1陽性、マクロファージはF4/80陽性細胞とし、感染後3日目、7日目、21日目に鼻腔洗浄を解析したところ、いずれも野生型マウスとNKT KOマウスで好中球数、マクロファージ数ともに有意差は認められなかった。さらに野生型マウスを用いて鼻腔洗浄液中のNKT細胞数 (CD1d+CD3+)をFACS解析したところ、感染後3日目、7日目、21日目、28日目いずれにおいてもNKT細胞は検出されなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでにNKT細胞欠損マウスにおいて、肺炎球菌の鼻咽頭定着に対する晩期クリアランスが低下することが明らかとなり、鼻腔洗浄液中にNKT細胞が検出されないこと、これまでの報告で肺炎球菌の鼻咽頭クリアランスに重要な自然免疫細胞である好中球数、マクロファージ数において、野生型マウスとNKT KOマウスで変化がないことを明らかにできている。これらのことから考慮すると、NKT細胞の鼻咽頭クリアランスとの関連性は、晩期クリアランスに重要な宿主因子、特にマクロファージ機能 (貪食殺菌能など)や液性免疫 (特異的IgG抗体産生量など)に間接的な影響を及ぼしている可能性が示唆された。2021年度はNKT細胞の局在、肺炎球菌クリアランス機構の詳細について更に検討を進めていく予定である。

Strategy for Future Research Activity

KT細胞の宿主免疫に及ぼす影響について、まずは鼻腔洗浄液中のIgG抗体量についてWhole Cell ELISAで解析し野生型マウスと比較する。さらに肺炎球菌定着21日目のNKT細胞KOマウスおよび野生型マウスの腹腔マクロファージを抽出し、肺炎球菌の貪食殺菌能をin vitro解析を行う。NKT細胞の局在としてNALT (鼻咽頭関連リンパ細網組織)を疑い、組織採取後、FACS解析を行う。以上の検討と並行して感染21日目の野生型マウスとNKT KOマウスの肺炎球菌定着前後の鼻腔洗浄液を用いたRNA seqを行うことでNKT細胞の鼻咽頭免疫に及ぼす影響も網羅的に解析する。

Causes of Carryover

野生型マウス、NKT KOマウスを用いたP1121株の鼻咽頭定着実験について問題なく再現できたことで、使用マウス数、試薬、消耗品類を節約することができた。次年度は当該助成金と翌年度分を合わせ、NKT細胞の鼻咽頭免疫における役割を明らかにすべく、網羅的解析および標的を絞った解析を同時に行なっていく予定である。