2023 Fiscal Year Research-status Report
Functional analysis of salt-inducible kinase and steroid-producing tissues by targeted proteomics and mass spectrometry
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20K08867
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
秦野 修 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (40164850)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹田 浩之 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (40609393)
竹森 洋 岐阜大学, 工学部, 教授 (90273672)
大西 健 茨城県立医療大学, 保健医療学部, 名誉教授 (50152195) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 塩誘導キナーゼ / 質量分析 / プロテオミクス / ステロイドホルモン / 近接依存性ビオチン化酵素 / BioID |
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| Outline of Annual Research Achievements |
塩誘導キナーゼ（SIK1,2,3)はAMPKファミリーに属し、SIK1,2,3 の各欠損/変異マウスはステロイドホルモン産生酵素の発現異常、生殖異常、代謝異常、軟骨形成異常、睡眠異常、虚血性疾患などの多彩な異常を呈する。これら多様な表現型異常に関与する SIK1,2,3 の機能発現機構を明らかにする目的で、SIK1,2,3 に結合するタンパク質について、愛媛大学プロテオサイエンスセンターが構築した約8,300種のヒトタンパク質アレイ（DNA結合タンパク質群やプロテインキナーゼ群などを機能種別にほぼ網羅的に含む）から AlphaScreen 法を用いて、SIK1,2,3 各種の全長タンパク質との結合実験を行ない、SIK1,2,3 各種に強く結合するヒトタンパク質を、各々約20種同定した。これらの AlphaScreen 結合実験は、in vitro で合成されたタンパク質同士の結合スクリーニングであるが、今年度は、より生体（in vivo）に近い培養細胞中での SIK1の相互作用タンパク質を同定するために、最近、開発された近接依存性ビオチン化酵素(AirID)を用いて、培養細胞内におけるSIK1の結合/相互作用タンパク質の同定（BioID法）を行っている。本研究では、SIK1-3のうち最初にステロイド産生に関与する分子として単離された SIK1 について、AirID との融合cDNA (AirID-SIK1と逆順のSIK1-AirID)を作成後、ヒトHEK293A細胞に導入し、近接位に存在してビオチン化されるタンパク質の網羅的同定をLC-MS/MS法で行なったところ、AirID 単独導入に比べて、AirID-SIK1 融合タンパク質導入時において強くビオチン化されるタンパク質として、AirID-SIK1/AirID のビオチン化量比が50以上のタンパク質が、17個同定された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト塩誘導キナーゼ（SIKs)の全長タンパク質と、ヒトタンパク質（転写因子群やプロテインキナーゼ群等をほぼ網羅的に含む）との in vitro での結合スクリーニング実験を行い、又、生体（in vivo）により近い培養細胞条件下においてSIKsと相互作用するタンパク質を同定するために、ヒトSIK1の全長タンパク質に近接依存性ビオチン化酵素(AirID)を連結した発現プラスミドを作成し、培養細胞中でのSIK1の近接位に存在するタンパク質（結合/相互作用タンパク質）の網羅的な同定を、LC-MS/MS法で行っているから。
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| Strategy for Future Research Activity |
塩誘導キナーゼ(SIKs)の機能発現機構を明らかにする目的で、生体（in vivo）により近い培養細胞内での、SIK1 の相互作用タンパク質を同定し、又、並行して行っている SIK2,3 結合タンパク質の解析との比較から、SIK1,2,3 全体で共通の、及び、SIK1,2,3 各々に固有の結合タンパク質を同定し、SIK1,2,3 タンパク質の個々の機能発現機構の相違などを明らかにしていきたい。又、同定されたタンパク質において、主にステロイドホルモン産生細胞/組織での発現/機能解析等を行っていきたい。
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| Causes of Carryover |
2024年度への研究年度の延長を行ったため、年度内に使い切るのでなく次年度に繰り越して有効に経費を使用するため、次年度使用額が生じた。次年度使用額は消耗品に使用する。
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[Journal Article] Simple methods for measuring milk exosomes using fluorescent compound GIF-2250/22762024
Author(s)
Furukawa S, Kawaguchi K, Chikama K, Yamada R, Kamatari YO, Lim LW, Koyama H, Inoshima Y, Ikemoto MJ, Yoshida S, Hirata Y, Furuta K, Takemori H.
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Journal Title
Biochem Biophys Res Commun.
Volume: 696
Pages: 149505
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Intermittent inhibition of FYVE finger-containing phosphoinositide kinase induces melanosome degradation in B16F10 melanoma cells.2023
Author(s)
Kawaguchi K, Watanabe M, Furukawa S, Koga K, Kanamori H, Ikemoto MJ, Takashima S, Maeda M, Oh-Hashi K, Hirata Y, Furuta K, Takemori H.
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Journal Title
Mol Biol Rep.
Volume: 50(7)
Pages: 5917-5930.
DOI
Peer Reviewed
